原标题: 研究长时间补料批次细胞培养过程中观察到的代谢差异

研究背景和目的

本文来自Biogen Idec公司的Alan Gilbert、Kyle McElearney、Rashmi Kshirsagar、Martin S. Sinacore和Thomas Ryll，发表在Wiley Online Library的期刊《Biotechnology Progress》上，在线发布日期为2013年9月10日。研究旨在探讨一种长达13天的补料批次（Fed-Batch）培养工艺中观察到的代谢差异，尤其是细胞在相同操作条件下表现出不同的代谢行为，如葡萄糖摄取率和乳酸产生率等。

学术背景和研究动机

研究领域

本研究属于细胞培养和生物反应器（Bioreactor）领域。近年来，基因工程和生物工艺方法的改进使得哺乳动物细胞培养过程能够实现更高的产量。通过基因扩增和共表达抗凋亡基因（如Bcl-xL），细胞能够在生物反应器中显示出较高的生产力。

研究问题

尽管工艺具有高度可重复性，但在相同操作条件下，部分细胞群体在12天后显示出较大的代谢变异，这主要表现在细胞特异性葡萄糖摄取率和乳酸产生率的增加上。为了解这个现象的原因，研究人员进行了深入的实验研究。

研究方法和实验流程

细胞株和培养基

研究中使用的细胞株是一种产生产单克隆IgG1抗体的无糖苷化的Chineses Hamster Ovary（CHO）细胞株，使用无血清培养基（Serum-Free Medium）培养。

培养条件

• 工作体积为1升的3升摇瓶培养
• 36摄氏度，5%二氧化碳
• 使用5升玻璃Applikon生物反应器，控制温度为35摄氏度，pH值为7.1±0.2
• 进料培养基（CF2B）设计为完全营养补充，每日补料直到收获和细胞培养停止的前一天。

整个过程中采用完全相同的种子细胞传代次数以确保基因一致性，避免基因突变影响结果。

离线分析

• 使用Cedex仪器分析细胞密度和存活率
• 葡萄糖和乳酸浓度使用Nova Bioprofile分析
• 氨离子、钾、钠离子浓度测量
• 抗体浓度使用HPLC系统测量
• TCA循环中间体加入到不同实验组中，以研究其对乳酸生产表型的影响。

主要研究结果

初步发现

研究观察到在培养的最后几天（第12天）出现了代谢变异现象，包括高乳酸产生率（LPR）和葡萄糖摄取率的变化。同样的培养条件下，即使是平行生物反应器也表现出不同的LPR，表明这是一个复杂且微妙的生物过程。

测试不同的进料策略

通过改变进料速率和培养基组成，发现过量进料直接导致高LPR和代谢变化。在第12天，所有具有高LPR表型的培养都显示出较高的细胞特异性进料比率（CSFR0）。将种子密度降低25%以增加CSFR0，结果表明高LPR表型与CSFR0的增加有关。

TCA循环中间体的影响

通过添加α-酮戊二酸和柠檬酸，研究了这些中间体对代谢变异的影响。结果表明，这些中间体能有效降低乳酸生产，并对培养基外环境中的氨、谷氨酸和谷氨酰胺浓度产生显著影响。

线粒体膜电位

使用流式细胞术和荧光染色法研究了线粒体膜电位的变化。结果显示，高LPR表型的细胞表现出较高的线粒体膜电位，与使用抗生素尼卡菌素处理的细胞类似，而补充TCA循环中间体的细胞线粒体膜电位较低。

氧气吸收率（OUR）

分离出的高LPR培养物中未观察到细胞特异性OUR的显著下降，表明线粒体功能可能并未完全受损，仅存在部分功能障碍。

研究的意义和价值

通过详细的生物反应器操作和纷繁复杂的代谢途径分析，本研究为理解哺乳动物细胞长期补料批次培养中的代谢变异提供了新见解。研究表明，过量进料和细胞特异性的进料策略是引起代谢变异的重要因素。研究还发现了线粒体在这种代谢变异中的重要角色，通过补充TCA循环中间体可以部分缓解这种现象。

研究亮点

• 确定了过量进料是导致代谢变异的主要原因，提出了细胞特异性进料比率（CSFR0）的概念。
• 研究了TCA循环中间体对培养过程的影响，发现其能够有效降低乳酸生产率。
• 首次通过线粒体膜电位分析揭示了代谢变异的部分机制。

总的来说，这项研究为未来的细胞培养工艺优化提供了重要的基础数据和理论支持，有助于提高生物制药生产过程中的生产率和稳定性，并为进一步研究线粒体在细胞代谢中的角色提供了新的方向。