本文报告了一项由Genentech公司开展的原始研究，题为“resilient immortals, characterizing and utilizing bax/bak deficient chinese hamster ovary (cho) cells for high titer antibody production”。该研究于2013年4月18日在线发表于Wiley Online Library上，文章的主要作者为Shahram Misaghi、Yan Qu、Andrew Snowden、Jennifer Chang和Brad Snedecor。
学术背景
该研究属于生物技术和细胞生物学领域，旨在解决大规模生产治疗性蛋白质过程中常见的问题，即细胞由于凋亡（apoptosis）导致的死亡，这会降低生物反应器中产物的积累。尽管已尝试通过过表达抗凋亡蛋白或下调促凋亡蛋白的方法来解决这一问题，但这些方法各自存在不足，难以有效用于大规模生产中。为了进一步改进，研究团队生成了缺失Bax和Bak（促凋亡蛋白）的二氢叶酸还原酶缺失（DHFR2/2）的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系，并利用这些细胞来提高抗体的生产效率。
研究流程
具体来说，研究利用锌指核酸酶技术生成了Bax/Bak双缺失（DKO）的DHFR2/2 CHO细胞系。这些细胞具有抗凋亡能力，并能够在高密度条件下实现更高的抗体效价。以下为主要实验步骤和所用方法：
DKO细胞系的生成：
- 使用锌指核酸酶技术，靶向Bax和Bak基因位点，造成基因断裂并通过修复引入突变，从而打断基因表达。
- 通过PCR扩增、限制性内切酶消化及DNA测序确认基因打断的效果。
表达构建体的克隆和筛选：
- 将抗体重链和轻链构建体克隆至质粒载体中，并利用巨细胞病毒启动子以及嘌呤霉素和DHFR基因作为选择标记。
- 通过大肠杆菌表达系统表达并纯化这些构建体。
抗体生产细胞系的选择：
- 将DKO细胞和亲本CHO细胞（作为对照）稳定转染质粒，分别使用甲氨蝶呤和嘌呤霉素作为选择标记来筛选表达抗体的克隆。
- 通过ELISA方法初步筛选出高效表达抗体的克隆进行进一步分析。
- 此外，还用ELISA-based Equal Seeding Density Assay（ESDA）对选出的克隆进行培养和摇瓶实验，测量其抗体效价。
凋亡和抗药性试验：
- 用甲氨蝶呤和嘌呤霉素对亲本细胞和DKO细胞进行培养，并使用流式细胞术和Annexin-V染色检测细胞的凋亡率。
- 使用琼脂糖蛋白染色评估细胞的线粒体质量和膜潜力，以确定细胞活性与增殖能力。
数据分析：
- 对所有试验数据进行统计分析，以确定相关性和显著性。
主要研究结果
细胞系特征：
- 确认通过锌指核酸酶技术生成的DKO细胞稳定缺失Bax和Bak蛋白，不会发生凋亡。
- 亲本细胞在甲氨蝶呤存在下表现出明显的细胞死亡，而DKO细胞则显示出对甲氨蝶呤的耐受性。然而，嘌呤霉素在两类细胞中均能诱导细胞死亡，但DKO细胞的死亡率较低。
抗体生产：
- 使用嘌呤霉素选择的DKO细胞克隆表现出更高的细胞密度，抗体效价也相对更高。DKO克隆在14天摇瓶培养中的生产能力几乎是其亲本细胞的两倍。
- 进一步实验表明，DKO克隆在Sodium Butyrate（丁酸钠）存在下能够保持高效抗体表达而不发生凋亡，而亲本细胞在相同条件下出现显著凋亡并导致抗体效价下降。
线粒体分析：
- 使用Mitotracker Green和JC-1染色，发现DKO细胞具有更多更健康的线粒体，这可能是其增长速度和存活率较高的原因之一。
长期稳定性：
- 通过对转染了不同抗体表达载体的DKO细胞进行长期培养和冷冻保存后复苏实验，确认DKO细胞能够稳定地保持高抗体效价和高细胞密度。
研究结论
该研究的主要结论是Bax/Bak双缺失CHO细胞可以有效用于大规模抗体生产，并显示出较好的抗凋亡能力和更高的生产效力。这些细胞在工业规模生产中可能具备极大的应用潜力，可以显著提高抗体产量并降低生产成本。
研究亮点
- 重要发现： 该研究确认了缺失Bax/Bak基因的CHO细胞具有较高的抗凋亡能力和更好的生产性能。
- 新颖性： 创建并表征了不同于传统细胞系的新型抗体生产细胞系，揭示了通过基因编辑技术改造细胞代谢途径的新方法。
- 方法特性： 首次证明zinc finger nuclease（锌指核酸酶）的应用，成功生成并选择适用于工业规模抗体生产的CHO细胞克隆。
其他有价值内容
该研究还探讨了抗凋亡蛋白在细胞生长和代谢中的复杂作用，并进一步提出了优化生产效率的方法和潜在方向，为未来的研究和应用提供了重要参考。