本文由 Alexander G. Allen 等研究者完成，隶属 Editas Medicine 公司，发表于 《Nature Biotechnology》（2024年3月，卷42，458–469）。论文研究了一种名为 SLEEK（Selection by Essential-gene Exon Knock-in）的高效基因敲入技术。
基于细胞的医学（cell-based medicine）已成为解决癌症、自身免疫疾病和血红蛋白病等重大疾病的重要工具。例如，嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法已显著改善针对 CD19 或 BCMA 抗原的血液恶性肿瘤的治疗效果。此外，天然杀伤细胞（NK cells）的工程化也显示出治疗实体瘤的潜力。
目前，基因敲入技术逐渐从随机整合（如使用伽马逆转录病毒和慢病毒载体）发展到基于 CRISPR–Cas9 的位点特异性敲入。然而，这些方法面临效率和制造成本的瓶颈。主要问题包括： 1. CRISPR–Cas9诱导的双链断裂（DSB）更倾向于通过非同源末端连接（NHEJ）修复，而非同源重组修复（HDR）。 2. 使用腺相关病毒（AAV6）载体虽然效率较高，但成本昂贵且存在载荷大小限制。
为此，研究团队设计了 SLEEK 技术，以在保持高基因敲入效率的同时解决上述问题。
本研究旨在开发一种高效、低成本且通用的基因敲入方法，通过使用 SLEEK 技术实现多种转基因负载的稳定整合，同时保持细胞的长期生存能力和扩增能力。
SLEEK 技术的核心理念是利用CRISPR核酸酶对必需基因（essential gene）外显子进行靶向敲入。该技术包括以下步骤： 1. 靶点选择：选择对细胞生存至关重要的基因（如 GAPDH）的外显子作为敲入位点。 2. 基因编辑：设计 DNA 敲入模板，使正确敲入的 DNA 修复可以恢复必需基因的功能，并整合目标转基因。 3. 负向选择机制：如果发生非产物性突变（如插入/缺失突变），细胞将因丧失必需蛋白的功能而死亡，从而实现自动筛选。 4. 数据分析：通过荧光显微镜、数字 PCR 和流式细胞术评估敲入效率。
高敲入效率：
在 诱导多能干细胞（iPSCs） 中，SLEEK技术实现了超过 90% 的敲入效率；在B细胞、T细胞和NK细胞中，效率在 85% 至 95% 之间。
转基因的表达稳定性：
敲入的转基因依赖内源性 GAPDH 启动子驱动表达，避免了外源启动子可能导致的沉默问题。
非病毒模板的适配性：
SLEEK 能与线性双链 DNA 和单链 DNA 模板兼容，成功实现高效敲入。这一成果降低了对病毒载体的依赖，减少了毒性并降低制造成本。
多基因敲入能力：
SLEEK 可以通过单一载体实现多达4种转基因的共敲入，并通过调整基因排列位置实现表达水平的精确控制。
适用多种细胞类型：
除 iPSCs 外，SLEEK 在初级 B 细胞、NK 细胞和 T 细胞中的效率显著高于传统方法。此外，与 T 细胞中最常用的 TRAC 基因敲入方法相比，SLEEK 技术表现出 100 倍的高效性。
临床意义：
通过将 CD16 和 mIL-15 双敲入到 iPSCs 并分化为 NK 细胞（INK），SLEEK 技术在体内外均表现出显著的肿瘤杀伤效果和持久性。这种技术为实体瘤免疫治疗提供了潜在的突破。
创新性：
结合必需基因外显子靶向策略和自动筛选机制，大幅提高了基因敲入效率。
多功能性：
可通过调整目标位点和基因排列实现精确的表达调控。
成本效益：
非病毒模板的适用性为细胞药物的制造提供了更经济的选择。
安全性：
经过严格的脱靶验证，未发现明显的脱靶效应或基因组重排问题。
广泛适用性：
该技术能够适配多种临床相关细胞类型，推动更复杂多功能细胞治疗的实现。
本研究展示了 SLEEK 技术在推动下一代细胞药物开发中的潜力。通过显著提高基因敲入效率、稳定性和多功能性，SLEEK 技术为治疗复杂疾病（如癌症）提供了新的解决方案。同时，它对细胞治疗的制造成本降低也具有深远影响。未来研究将聚焦于更多必需基因位点的验证以及多转基因敲入在其他应用中的探索。