本文是一篇综述文章，作者包括 Ke Yue、Junyu Chen、Yingqiu Li 和 Lei Kai，均来自江苏师范大学生命科学学院，发表于 Computational and Structural Biotechnology Journal。文章接收于 2023 年 2 月 15 日，修改完成于 5 月 3 日，并于 5 月 4 日在线发表。本文主要回顾了无细胞蛋白质合成（Cell-Free Protein Synthesis，CFPS）技术的最新进展及其在合成生物学中的广泛应用，同时探讨了该技术的当前挑战与未来展望。
随着人类对绿色、可持续发展的需求不断增长，生物技术逐渐成为代替石化工业的重要领域。合成生物学作为一个融合生物学、工程学和技术学科的交叉领域，已经在生物产品的开发和服务创新方面显示出巨大的潜力。近年来，CRISPR/Cas 等基因编辑工具的突破进一步推动了合成生物学的发展，使得精确、快速的生物系统工程成为可能。然而，传统的基于细胞的系统在质量和能量转化效率上存在固有限制，制约了进一步的优化。
无细胞蛋白质合成技术作为一种突破性工具，能够通过移除细胞膜和细胞冗余部分，直接解析和操控中心法则，从而克服这些限制。这种开放性为合成生物学的模块化编程提供了新的可能性。
无细胞蛋白质合成技术通过提取细胞内的转录、翻译以及能量再生系统，形成一个去除生命体系限制的简化版本。其开放性允许研究人员引入非天然化学物质进行直接调控，提高系统灵活性。这项技术最早由 Nirenberg 和 Matthaei 用于破解遗传密码，随后逐渐被用于重组蛋白质的生产，特别是那些在细胞中难以表达的膜蛋白和毒素。
CFPS 的主要优势包括： 1. 快速反馈循环：CFPS 显著缩短了设计-构建-测试（Design-Build-Test）周期。 2. 系统灵活性：能够通过添加特定调控因子或非天然分子实现复杂功能。 3. 独特应用场景：如膜蛋白的表达、基因回路原型的设计和测试等。
极简细胞的研究旨在从简单分子如脂肪酸、DNA 或 RNA 开始，逐步构建出具有活细胞基本特性的仿生系统。CFPS 技术在以下方面发挥了重要作用： - 分隔与能量再生：通过磷脂或聚合物自组装的囊泡形成隔离系统，同时集成 ATP 合成装置，支持能量再生。 - 自我复制与分裂：研究表明，利用 CFPS 系统，可以实现 DNA 的自我复制以及合成细胞膜的自发生长与分裂。 - 通信与运动：通过合成基因回路和分子马达模块，进一步赋予仿生系统以复杂功能。
无细胞代谢工程（Cell-Free Metabolic Engineering，CFME）利用纯化酶或细胞裂解液构建代谢路径，从而快速高效地生产目标产物。CFME 的优势在于： - 避免细胞毒性：CFME 可规避细胞毒性问题，提高目标分子的产量。 - 优化与故障排查：由于反应发生在体外环境中，优化代谢途径变得更加直观和灵活。
例如，通过 CFPS 系统设计的甲瓦酸合成途径，产量从最初的 1.6 g/L 提高到 17.6 g/L，仅需不到一天即可完成多种候选酶的测试与优化。
CFPS 系统因其独特优势被广泛应用于重组蛋白的生产，包括抗体、疫苗抗原和抗菌肽等。其应用场景包括： - 工业规模：某些公司已成功开发出可容纳千升反应体系的 CFPS 技术，用于快速开发药物。 - 现场生产：CFPS 系统可以冷冻干燥以便储存，随时通过水化激活，用于生产疫苗或应急治疗药物。
结合 DNA 编辑技术（如 CRISPR/Cas），CFPS 系统在体外诊断中展现出巨大潜力。例如，研究者开发了一种基于冷冻干燥遗传电路的三层设备，可快速检测病毒 RNA 或环境污染物，其反应时间缩短至 60 分钟以内。
尽管 CFPS 技术发展迅速，仍面临以下挑战： 1. 生产效率：当前 CFPS 系统的蛋白质合成效率远低于活细胞水平，需要进一步优化能量再生系统和核糖体功能。 2. 标准化问题：不同实验室采用的细胞裂解液来源和制备方法多样，缺乏统一的标准，影响了实验数据的可比性。 3. 成本控制：CFPS 系统的成本仍高于传统的化学合成方法，需要通过规模化生产和工艺优化降低成本。
未来，随着人工智能和计算建模技术的融合，CFPS 技术有望实现更精确的路径设计和效率预测，进一步推动其应用范围扩展到更广泛的生物制造领域。
无细胞蛋白质合成技术的快速发展正为合成生物学开辟新天地。从极简细胞的构建到代谢工程的优化，再到生物分子生产和体外诊断的应用，这一技术显示出广阔的前景。尽管目前仍存在技术障碍，但随着研究的深入和效率的提升，CFPS 技术有望成为生物技术领域的颠覆性工具。