这篇文献是一项关于无细胞基因表达的原研究报告。该研究由Blake J. Rasor、Payal Chirania 和 Grant A. Rybnicky 等科学家领导，分别来自Northwestern University和Oak Ridge National Laboratory。研究发表于2023年1月26日《ACS Synthetic Biology》期刊。

无细胞系统是一种以不依赖活细胞的方式，通过粗细胞提取物研究生物学过程和进行基因合成的系统。无细胞基因表达技术（Cell-Free Gene Expression, CFE）近年来成为合成生物学领域的一个重要工具，能够用于原型设计、蛋白质生产和生物传感器等应用。E. coli细胞提取物是无细胞系统中最常用的平台，该研究旨在通过不同的裂解后处理方式改善和优化E. coli提取物的处理方法，从而深入理解这些处理步骤对蛋白质组合、代谢物和基因表达活性的影响。

学术背景

在合成生物学中，无细胞系统提供一种简化的方式来研究复杂的生物过程，因为它摒弃了细胞成活、复制和膜屏障的约束。E. coli提取物由于其多功能性和被广泛优化的特性，被广泛用于CFE系统中。然而，提取物的复杂成分，包括数千种蛋白质和数百种代谢物的反应网络，使我们对其内部变化的认识仍有限。本研究通过不同的裂解后处理方法，包括离心、延长翻译（runoff）和透析（dialysis），分析了提取物中蛋白质和代谢物的潜在机制变化。

研究方法

研究通过以下实验方法进行了全方位分析：

1. 裂解后处理对CFE的影响：研究首先评估了裂解后处理步骤对E. coli提取物转录和翻译综合运作的影响。通过在不同缓冲盐条件下（乙酸盐和谷氨酸盐）制备的未处理提取物、经过延长翻译、透析或双重处理的提取物比较CFE的表现。所得结果显示，裂解后处理显著增加了来自σ70启动子的基因表达。

2. 代谢组学和蛋白质组学分析：

   • 代谢组学分析：利用气相色谱-质谱法（GC-MS）和液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS），从提取物样品中识别和量化各代谢物和蛋白质相对丰度。这些分析提供了提取物在不同处理步骤条件下的代谢物和蛋白质组成及其变化的详细描述。
   • 蛋白质组学分析：通过高质量的蛋白质定量，涵盖了E. coli基因组的45.5%，分析了不同处理条件下未处理提取物相对于对应处理后的蛋白质丰度变化。研究识别了在裂解后处理过程中显著减少的蛋白质，尤其是涉及到转录和翻译的蛋白质。

3. 蛋白质补充实验：识别关键蛋白后，研究进一步通过补充这些蛋白至处理后的CFE反应中，观察它们对基因表达率的影响，确认了冷休克蛋白（cold-shock proteins）和RNase相关蛋白的显著影响。

研究结果和讨论

研究得出的主要结论是，裂解后处理，尤其是延长翻译步骤，显著改变了E. coli细胞提取物的蛋白质组，让σ70启动子的基因表达能力增强。蛋白质组学分析指出，蛋白质的减少可能对CFE活性产生影响，而代谢物的变化在不同处理步骤的影响下也提供了对基因表达机制的重要洞见。对于这些变化，冷休克蛋白和RNase相关蛋白被识别为可能影响基因表达的重要因素。

研究的意义和价值

这项研究不仅揭示了E. coli提取物在裂解后处理中的复杂生物化学变化，更强调了通过代谢组学和蛋白质组学提供深刻见解的能力。文献详尽地展示了如何利用这些分析理解无细胞系统中的复杂交互作用，并提供了系统地优化和定制CFE系统以满足特定应用的机会。例如，深入理解冷休克蛋白和其他效应蛋白在CFE中的作用，可能有助于在更广阔的范围内提高蛋白质合成效率和可靠性。

学术价值与应用前景

该研究不仅在科学上揭示了CFE系统的内在复杂性，还具有实用的应用价值。通过优化提取物处理方法和理解底层生物化学变化迹象，研究人员可以改善CFE系统的有效性和一致性，从而在实际应用中取得更显著的效果。无细胞系统的优化和分析方法今后在生物合成、药物研发等诸多领域将发挥更重要的作用。

总之，本研究通过多种技术手段，系统性地揭示了不同裂解后处理步骤对E. coli提取物的蛋白质和代谢物特性的影响，为未来无细胞系统的研究和应用奠定了坚实基础。