主要作者及研究机构

该研究由Liang Tang、Yan Wang、Ju Xiang、Dawei Yang、Yan Zhang、Qin Xiang和Jianming Li共同完成。研究团队来自多个机构，包括长沙医学院基础生物学系、梧州医学院基础生物学系、长沙医学院神经科学与行为研究中心、湖南省高校功能核酸基础与临床研究重点实验室以及中南大学计算机科学与工程学院。该研究于2023年发表在《Experimental and Therapeutic Medicine》期刊上。

学术背景

阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease, AD）是一种进行性、持续性的中枢神经系统退行性疾病，主要表现为认知障碍和记忆障碍。目前，AD的发病机制尚不明确，且缺乏有效的治疗方法。尽管胆碱酯酶抑制剂在临床上被广泛使用，但这些药物只能缓解症状，无法根治疾病。近年来，天然药物如多糖、苯丙素、黄酮类、生物碱、皂苷和多酚等被认为具有治疗AD的潜力。

雷公藤多苷（Tripterygium Glycosides, TG）是从雷公藤根皮中提取的总苷，已被用于治疗类风湿性关节炎、狼疮性肾炎、糖尿病和格林-巴利综合征等疾病。动物实验表明，TG对中枢神经系统具有保护作用，能够显著改善由脂多糖（LPS）诱导的星形胶质细胞炎症损伤。然而，TG在AD中的作用机制尚不明确。

非编码RNA（ncRNA），包括长链非编码RNA（lncRNA）、环状RNA（circRNA）和微小RNA（miRNA），在多种生物过程中发挥重要作用。研究表明，lncRNA和circRNA可能参与AD的发病机制，并被认为是AD的风险因素、进展标志物和治疗靶点。然而，TG在AD治疗中调控的lncRNA和circRNA尚未被确定。因此，本研究旨在通过微阵列技术评估TG处理的AD小鼠模型中lncRNA和circRNA的表达谱，以揭示TG在AD中的作用机制。

研究流程

1. AD小鼠模型的构建
   研究使用24只C57BL/6J小鼠，分为AD+TG组和AD+生理盐水（NS）组。AD模型通过Aβ25-35诱导构建，TG组小鼠每天腹腔注射TG（0.25 mg/10 g），NS组小鼠注射生理盐水，持续4周。实验结束时，每组随机选取3只小鼠的海马组织进行后续分析。

2. 组织收集与RNA提取
   小鼠海马组织被分离并储存于-80°C，使用TRIzol试剂提取总RNA，并通过DNase I去除DNA污染。RNA质量通过NanoDrop分光光度计进行定量。

3. 微阵列分析
   使用Agilent表达谱芯片对6个样本（AD+NS组和AD+TG组各3个）进行PCR扩增和荧光标记。标记的cRNA通过RNA提取和纯化试剂盒进行纯化，并与Agilent-085631微阵列杂交。数据通过Feature Extraction软件读取，并使用R软件中的limma包进行归一化处理。筛选出差异表达的lncRNA、circRNA和mRNA（fold change ≥2，p<0.05），并进行聚类分析。

4. RT-qPCR验证
   随机选择4个lncRNA、4个mRNA和4个circRNA进行RT-qPCR验证，结果与微阵列分析一致。

5. 共表达网络分析
   使用Pearson相关分析计算lncRNA、circRNA和mRNA之间的相关系数，筛选出相关性显著的基因对，并使用Circos软件构建共表达网络。

6. PPI网络分析
   使用STRING数据库构建差异表达mRNA的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，筛选出关键基因。

7. 功能分类与通路分析
   使用GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析差异表达mRNA的功能和参与的生物通路。

8. lncRNA靶基因预测
   使用FEElnc软件预测lncRNA的顺式（cis）靶基因，使用Risearch软件预测反式（trans）靶基因。

9. lncRNA-靶基因-转录因子（TF）网络分析
   基于JASPAR数据库预测lncRNA结合的转录因子，并使用网络软件构建lncRNA-TF-mRNA调控网络。

10. circRNA-miRNA相互作用预测
    使用miRDB数据库预测circRNA与miRNA的相互作用，并使用Cytoscape软件构建circRNA-miRNA网络。

主要结果

1. 差异表达的lncRNA、mRNA和circRNA
   在TG处理的AD小鼠模型中，共筛选出661个差异表达的lncRNA、503个差异表达的mRNA和64个差异表达的circRNA。其中，POU4F1、EGR2、MAG和NR4A1是PPI网络中的关键基因。

2. 共表达网络分析
   lncRNA-mRNA共表达网络中共有648个节点和152,453条连接，circRNA-mRNA共表达网络中共有19,553对相互作用。

3. 功能与通路分析
   GO分析显示，差异表达的mRNA主要参与“细胞外区域”、“免疫系统过程”和“炎症反应”等生物过程。KEGG通路分析表明，差异表达的mRNA主要富集在“TNF信号通路”、“PI3K-AKT信号通路”和“Wnt信号通路”中。

4. lncRNA-靶基因-TF网络
   预测到98个转录因子和75个mRNA可能调控或作为lncRNA的靶基因，其中CEBPA、ZIC2和RXRA是最可能调控lncRNA的转录因子。

5. circRNA-miRNA相互作用
   预测到275个miRNA可能与64个circRNA结合，其中mmu_circ_0007187和mmu_circpedia_35174是最显著上调和下调的circRNA。

结论

本研究通过微阵列技术揭示了TG处理的AD小鼠模型中lncRNA、mRNA和circRNA的表达谱，筛选出多个可能作为AD治疗靶点的差异表达基因。研究结果表明，TG可能通过调控POU4F1、EGR2、MAG和NR4A1等关键基因，改善AD的病理过程。此外，lncRNA和circRNA在AD的发病机制中可能发挥重要作用，未来研究应进一步探讨这些非编码RNA的功能及其在AD治疗中的潜在应用。

研究亮点

1. 重要发现：本研究首次揭示了TG处理的AD小鼠模型中lncRNA、mRNA和circRNA的表达谱，筛选出多个可能作为AD治疗靶点的差异表达基因。
2. 方法新颖性：研究采用了微阵列技术、共表达网络分析、PPI网络分析等多种生物信息学方法，系统地分析了TG在AD中的作用机制。
3. 研究对象的特殊性：研究聚焦于非编码RNA在AD中的作用，为AD的发病机制和治疗提供了新的视角。

其他有价值的内容

本研究为AD的治疗提供了潜在的分子靶点，未来研究可以进一步验证这些靶点的功能，并探索其在临床治疗中的应用价值。此外，研究还揭示了lncRNA和circRNA在AD中的重要作用，为非编码RNA在神经退行性疾病中的研究提供了新的方向。