研究作者及发表信息
该研究由Yu Shirai、Maria-Dolors Piulachs、Xavier Belles和Takaaki Daimon共同完成，分别来自京都大学农业研究生院（日本）和进化生物学研究所（CSIC-Universitat Pompeu Fabra）（西班牙）。研究于2022年5月23日发表在Cell Reports Methods期刊上，文章标题为《DIPA-CRISPR: A Simple and Accessible Method for Insect Gene Editing》。
学术背景
昆虫是地球上多样性最丰富的生物类群之一，拥有超过100万种已知物种，是研究生物学基础问题的宝贵工具。然而，现有的昆虫基因编辑技术主要依赖于胚胎显微注射（embryo microinjection），这种方法需要昂贵的设备、特定的实验设置以及高度熟练的操作人员。此外，胚胎注射必须在卵产下后的极短时间内完成，这对许多昆虫物种（如蟑螂等）来说是不可行的，因为这些物种的卵被包裹在硬壳中，无法在早期胚胎阶段进行注射。
为了解决这些问题，研究团队开发了一种名为DIPA-CRISPR（Direct Parental CRISPR）的简单且高效的昆虫基因编辑方法。该方法通过直接向成年雌性昆虫注射Cas9核糖核蛋白（RNPs），从而在发育中的卵母细胞中引入可遗传的突变。DIPA-CRISPR的显著优势在于其无需复杂的胚胎注射操作，且适用于多种非模式昆虫物种。
研究流程
研究主要包括以下几个步骤：
实验对象选择：
- 研究选择了两种昆虫作为实验对象：德国小蠊（Blattella germanica）和赤拟谷盗（Tribolium castaneum）。这两种昆虫分别代表了半变态昆虫和全变态昆虫，且具有不同的生殖系统。
Cas9核糖核蛋白的制备：
- 使用商业化的Cas9蛋白和合成的单链向导RNA（sgRNA）制备Cas9核糖核蛋白（RNPs）。Cas9蛋白与sgRNA以1:2的摩尔比例混合，并在室温下孵育10-15分钟以形成RNPs。
成年雌性昆虫注射：
- 将Cas9 RNPs注射到成年雌性昆虫的血腔中。注射时间根据昆虫的生殖周期进行优化，例如在德国小蠊中，注射时间选择在卵囊脱落后4天。
基因编辑效率的评估：
- 通过表型筛选和基因分型（如异源双链迁移分析，HMA）评估基因编辑效率（GEF）。研究还测试了不同注射时间、Cas9剂量以及是否使用内体逃逸试剂（EER）对编辑效率的影响。
基因敲入实验：
- 在赤拟谷盗中，研究团队还尝试了基因敲入（knock-in）实验。通过注射Cas9 RNPs和单链寡核苷酸（ssODNs）作为同源定向修复（HDR）模板，成功实现了基因敲入。
主要结果
德国小蠊的基因编辑：
- 在德国小蠊中，DIPA-CRISPR的基因编辑效率（GEF）最高可达21.8%。通过优化注射时间，研究团队成功建立了首个基因敲除蟑螂品系。
赤拟谷盗的基因编辑：
- 在赤拟谷盗中，基因编辑效率在4天和5天龄的雌性成虫中分别达到50.8%和71.4%，与传统的胚胎注射方法相当。
基因敲入实验：
- 在赤拟谷盗中，研究团队成功实现了基因敲入，尽管效率较低（1.2%），但证明了DIPA-CRISPR在基因敲入实验中的潜力。
Cas9蛋白的比较：
- 研究还比较了不同公司生产的Cas9蛋白的性能，发现其编辑效率相似，表明DIPA-CRISPR对Cas9蛋白的选择具有较高的灵活性。
研究意义与价值
科学价值：
- DIPA-CRISPR为昆虫基因编辑提供了一种简单、高效且广泛适用的方法，尤其适用于那些无法通过传统胚胎注射进行基因操作的物种。该方法为昆虫生物学研究提供了新的工具，有助于揭示昆虫发育、进化和行为的分子机制。
应用价值：
- DIPA-CRISPR的简单性和可操作性使其能够在非专业实验室中广泛应用，特别是在农业害虫和医学昆虫的研究中具有重要应用潜力。例如，通过基因编辑技术控制害虫种群或阻断疾病传播媒介的功能。
研究亮点
方法创新：
- DIPA-CRISPR首次实现了通过成年雌性昆虫注射Cas9 RNPs进行基因编辑，避免了复杂的胚胎注射操作。
广泛适用性：
- 该方法适用于多种昆虫物种，包括蟑螂和赤拟谷盗等非模式昆虫，展示了其在昆虫基因编辑中的广泛潜力。
高效性：
- 在德国小蠊和赤拟谷盗中，DIPA-CRISPR的基因编辑效率分别达到21.8%和71.4%，与传统的胚胎注射方法相当。
低成本与易操作性：
- 使用商业化的Cas9蛋白和简单的实验设备，DIPA-CRISPR能够在非专业实验室中轻松实施，降低了基因编辑技术的门槛。
其他有价值的内容
研究还探讨了DIPA-CRISPR的局限性，例如需要深入了解目标昆虫的卵巢发育过程，以及在某些物种（如果蝇）中可能不适用。此外，研究团队提供了详细的实验方法和数据分析，为其他研究者提供了宝贵的参考。
总结
DIPA-CRISPR作为一种简单、高效且广泛适用的昆虫基因编辑方法，为昆虫生物学研究和害虫控制提供了新的工具。其创新性和实用性使其在未来的昆虫基因编辑领域具有广阔的应用前景。