这篇《Aquaculture》期刊发表的科学研究文章以“Comparative transcriptome analyses reveal changes of gene expression in larvae hatched from fresh and cryopreserved kelp grouper (Epinephelus moara) embryos”为题，研究了新鲜胚胎和冷冻保存胚胎孵化的海红石斑鱼（Epinephelus moara）幼体基因表达的差异性。这项研究的第一作者为Jingjing Zhang，通讯作者为Yongsheng Tian，主要研究单位包括中国水产科学研究院黄海水产研究所、青岛国家实验室海洋科学技术研究中心、上海海洋大学及大连海洋大学等。本研究在线发表于2021年9月，并作为期刊Aquaculture第547卷的一部分，是鱼类胚胎冷冻保存领域的一项重要进展。
鱼类胚胎冷冻保存技术为水生生物种质资源的长期保存提供了关键途径，但由于鱼类胚胎的较大体积、低透性、膜结构的特殊性及卵黄浓度高等因素，冷冻保存技术的开发备受挑战。以往研究报告虽然观察到少数种类在冷冻胚胎孵化形成健康个体的可能性，但尚未成功培养出能发育至成年阶段的鱼类。胚胎在冷冻和解冻过程中易遭受形态及功能损伤，特别是神经系统和器官发育异常，但其中的分子机制尚未揭示。本研究通过对新鲜胚胎和冷冻胚胎孵化幼体的转录组比较，首次深入探讨了胚胎冷冻保存对鱼类幼体基因表达的影响，试图揭示相关分子机制。
研究依托于黄海水产研究所的冷冻保存专利技术，以海红石斑鱼为模型，采用高通量RNA测序技术（RNA-Seq）对比分析新鲜胚胎和冷冻胚胎（包括冷冻后复苏孵化）的1日龄幼体基因表达情况。具体实验包括以下步骤：
样本收集与RNA提取：实验利用从山东省莱州市水产育种企业获得的胚胎，通过五步平衡法进行冷冻保存处理。分为两组：来自新鲜胚胎（BC组）和冷冻胚胎（FL组）的新孵化幼体，各组设置三次生物学重复，每次重复测试3条幼体。
cDNA文库构建与高通量测序：利用Illumina HiSeq™ 4000平台开展测序工作，数据经初步过滤后进行组装，形成全新的转录组序列。
数据分析：通过基因功能注释（GO）、基因互作相关路径分析（KEGG）等数据库对转录组进行全面分析，对差异表达基因（DEGs）进行筛选（判断条件：FDR < 0.05，|log2(FC)| > 1），并对部分表达显著基因进行qRT-PCR验证。
实验验证：对比18个关键基因在两组转录组中表达水平变化，以确保数据可靠性，验证差异表达基因所反映的实际生物学意义。
转录组数据：研究共获得57,157个unigene，其中54.7%注明了至少一种数据库注释，表明海红石斑鱼转录组数据仍有待进一步完善。基因长度在200至11,794 bp之间，GC含量为45.49%，反映了数据的高质量。
差异表达基因（DEGs）分析：研究共检测到1815个显著差异基因，其中1165个基因上调表达，650个基因下调表达。大量差异基因与发育相关途径有关，包括神经发育、眼睛发育、光敏感知和神经递质运输入相关的基因显著下调。
基因功能富集：
冷冻保存对钙离子调控的影响：研究发现钙信号通路中关键基因（如CABP1、CAMK2A等）表达明显下降，而钙离子在细胞信号传递、胚胎发育、细胞分裂等过程中起关键作用，其损伤可能导致幼体器官、特别是神经系统发育的异常。
主要生物学意义：冷冻胚胎孵化幼体的神经系统和眼睛可能受到冷冻/解冻过程中的脱水与复水作用干扰产生的代谢和结构性损伤，可能导致视觉、运动和生理适应能力的缺陷，造成个体发育失败。
这是首次通过转录组测序系统性揭示鱼类胚胎冷冻保存对其孵化幼体基因表达和生理特性影响的研究。研究不仅丰富了海红石斑鱼的基因组与蛋白质组数据库，还提出了胚胎冷冻过程中可能发生的分子损伤机制，为优化胚胎保存技术提供了重要参照。此外，作者详细分析了特定差异表达基因及其与胚胎发育异常的分子联系，对于鱼类育种、生物种质资源保护等领域具有重要指导意义。
总之，本文展示了鱼类胚胎冷冻保存技术所带来的复杂性与挑战，同时为后续技术改进提供了一个基因表达变化参考标准，标志着鱼类冷冻保种领域向更高精度研究迈出了重要一步。