报告：针对 SARS-CoV-2 核衣壳蛋白的高度特异性单克隆抗体及表位鉴定，用于抗原检测测试

一、研究背景与发表信息

这项研究由 Yutaro Yamaoka、Kei Miyakawa、Sundararaj Stanleyraj Jeremiah 等人领导，主要作者隶属于日本横滨市立大学医学部微生物学系、神奈川化学株式会社、富士胶片公司等多个机构。文章于 2021 年 6 月 15 日发表在《Cell Reports Medicine》期刊，标题为《Highly specific monoclonal antibodies and epitope identification against SARS-CoV-2 nucleocapsid protein for antigen detection tests》。
通讯作者为 Akihide Ryo，联系邮箱为 aryo@yokohama-cu.ac.jp。

二、研究背景与研究目的

新冠肺炎（COVID-19）的大流行已成为全人类面临的重大公共卫生问题，其病原体为严重急性呼吸综合征冠状病毒 2（SARS-CoV-2）。尽管核酸检测（如 RT-PCR）是目前公认的诊断 COVID-19 的主要方法，但其需要专业设备和培训有素的技术人员，无法快速在大规模现场开展操作。同时，现有的快速抗原检测测试（POCT）因灵敏度有限，难以准确诊断无症状感染者，从而可能导致病毒的进一步传播。

核衣壳蛋白（Nucleocapsid Protein, NP）是一种在 SARS-CoV-2 病毒复制期间大量表达的抗原，因其高免疫原性而成为抗原检测测试的重要标靶。然而，SARS-CoV-2 与 SARS-CoV 的核衣壳蛋白在氨基酸序列上具有高同源性（约 90%），常导致检测的交叉反应性，从而限制了抗原检测的特异性。因此，本研究旨在开发更高特异性且能精准靶向 SARS-CoV-2 的单克隆抗体（Monoclonal Antibodies, mAbs），以建立可靠的抗原检测测试系统。

三、研究方法与技术流程

1. 抗原蛋白合成及抗体筛选

   • 研究通过小麦胚芽无细胞蛋白生产系统，成功合成了 N 端截短的核衣壳蛋白（ΔN-NP，121–419 位氨基酸）。
   • 将ΔN-NP 用作免疫原注射小鼠，提取经过免疫的淋巴细胞，与骨髓瘤细胞融合后获得了 144 个杂交瘤细胞株。
   • 初步筛选采用酶联免疫检测（ELISA）、AlphaScreen 和生物层干涉技术（Bio-layer Interferometry）三种方法，从 144 个杂交瘤中筛选出 12 个对抗原反应性强的克隆。
   • 进一步通过免疫印迹实验（Western blot）验证其特异性，并最终选出对 SARS-CoV-2 NP 高特异性、无交叉反应的 3 个克隆（编号为 No. 7、No. 9、No. 98）。

2. 表位分析

   • 通过 ELISA 和突变分析确定抗体结合的关键氨基酸位点：
     • Mab No. 7 靶向 210–231 位氨基酸。
     • Mab No. 98 靶向 382–397 位氨基酸。
     • Mab No. 9 靶向 335–348 位氨基酸。
   • 同源建模显示，上述表位位于核衣壳蛋白的外表面，适合多抗体对检测系统的联合应用。

3. 抗体的结合特性及针对不同 SARS-CoV-2 变异株的验证

   • 通过计算平衡解离常数（Kd），发现研究中开发的抗体比市售抗体具有更高的亲和力。
     
   • 针对当前主要的变异株（501Y.V1、501Y.V2、501Y.V3），序列对比显示这些抗体的表位不存在突变，表现出对变异株的高度适应性和通用性。

4. 抗原检测系统的开发和性能测试

   • ELISA 系统：基于 Mab No. 9 与 Mab No. 98 开发了夹心式抗原捕获 ELISA 系统，最低检测限为 3.2 pg/ml 的重组 SARS-CoV-2 NP 或 3.3 × 10⁴ 复制数/ml 的病毒颗粒。该系统在 RT-PCR 阳性样本中（Ct 值 <28）达到 100% 敏感性。
   • LFIA 系统：将上述抗体组合运用在侧向流免疫层析试纸（LFIA）中，并结合银离子放大技术增强信号可见性。该 LFIA 系统的检测限约为 6.25 pg/ml，大幅优于市售产品。

四、研究结果

• 特异性与灵敏度
  研究开发的抗体在免疫印迹和免疫荧光实验中均表现出良好的特异性，未与其他人类冠状病毒（包括 SARS-CoV）、流感病毒或呼吸道合胞病毒发生交叉反应。在变异株测试中，这些抗体对主要流行变异株表现出良好的识别能力。

• 临床应用性能
  ELISA 和 LFIA 系统对高病毒载量的样本（Ct 值 <28）具有高度敏感性，可检测出存在感染风险的活病毒样本。而 LFIA 系统在低病毒载量样本中（Ct 值 >31）的表现也优于现有的商用产品。

五、研究意义与应用价值

本研究开发的单克隆抗体及其基于的抗原检测测试系统，为 COVID-19 的快速筛查提供了可靠工具。这些系统不仅灵敏、特异，还克服了现有产品交叉反应的局限性，且能适应多种流行变异株的检测需求。在全球抗疫形势下，该成果具备显著的实际应用前景，尤其可用于现场大规模人群筛查和边远地区的疾病监测。

六、研究亮点

1. 创新点：采用小麦胚芽无细胞系统生成高质量抗原，成功开发特异性高、亲和力强的单克隆抗体。
2. 技术亮点：结合银离子放大技术设计了高度敏感的 LFIA 系统，在临床样本中远远优于市售抗原检测产品。
3. 适应性：可识别当前主要变异株（如 501Y.V1–V3），显现出极强的通用性。

七、局限性与展望

该研究虽然验证了抗体和检测系统的性能，但仍需更大规模的临床验证以确保实际应用效果。此外，作者指出需要晶体结构分析进一步明确抗体表位，未来的研究可在更多样本环境下评估 LFIA 的稳定性及表现。通过后续优化和推广，上述检测系统有望在全球疫情防控中发挥更大的作用。