这篇文章报告了《Comparative transcriptome analysis digs out genes related to antifreeze between fresh and frozen-thawed rooster sperm》，由北京农业大学动物科学与技术学院的Xiao-Long Qi、Kai Xing、Zhen Huang等共同撰写，并发表于《Poultry Science》（2020年99卷2841-2851页）。本文使用转录组分析技术研究了新鲜与冷冻解冻鸡精子之间的基因表达差异，同时评估了一种重组热休克蛋白HSP90对冷冻解冻精子质量的保护作用。下面我们全面介绍这项研究的关键内容。

研究背景与意义

精液冷冻保存技术在农业遗传资源保护及繁殖领域具有重要应用。但相比于牛等哺乳动物，家禽的精液冷冻保存在实践中存在诸多挑战，如冷冻后的精子存活率和受精能力较低，引起这一问题的主要原因包括冷冻过程中的失水、高渗透压、冰晶形成以及酸碱度变化等。然而，现有研究大多集中在优化冷冻保存条件和探索新型冷冻保护剂，而忽视了冷冻过程中影响鸡精子生理功能的抗冻基因表达特性。这篇文章首次系统地比较了新鲜和冷冻解冻鸡精子的转录组变化，试图揭示冷冻过程中基因表达的分子机制。同时，本文还通过添加重组HSP90蛋白，探讨了其对鸡精子冷冻保护的潜在机理，为改进家禽精液冷冻保存技术提供了重要的理论依据。

研究方法与流程

文章分为两个实验步骤（Trial 1和Trial 2）来实现研究目标：

实验1：鸡精子的转录组分析

1. 样本采集与制备：从6个月龄的健康雄性鸡（Hy-Line Brown品种）中挑选18个个体，通过腹部按摩法采集其精液，将精液分为新鲜组和冷冻解冻组。
2. 冷冻与解冻程序：使用Beltsville鸡精液稀释液稀释精子后，在液氮中进行冷冻保存，并通过37℃水浴方式进行快速解冻。
3. 转录组分析：利用Affymetrix GeneChip鸡基因组芯片分析两组精子的基因表达差异。具体流程包括提取RNA、制备cDNA、合成RNA探针和芯片混合杂交。
4. 基因功能研究：利用基因Ontology（GO）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析差异表达基因（DEG）的功能及信号通路。
5. 数据验证：通过qPCR选取关键DEG（如CIRBP、RHOA、HSP70和HSP90）验证芯片数据的准确性。

实验2：HSP90诱导的保护作用

为了评估HSP90对精子冷冻解冻后质量的影响，将收获的精液分为6组，分别在精液稀释液中添加0 mg/ml（对照组）、0.01 mg/ml至2 mg/ml不同浓度的重组HSP90蛋白，并分析其对精子活力和存活率的促进作用。

主要研究结果

1. DEG的鉴定与功能分析

① 基因表达变化：通过转录组分析，识别出2115个DEG，其中2086个基因在冷冻解冻组中显著下调，仅29个显著上调。 ② 功能富集分析：GO分析显示，这些DEG参与了多个重要的生物学功能，如蛋白质翻译、细胞代谢和细胞周期调控。KEGG路径分析表明，DEG显著富集于氧化磷酸化、核糖体、蛋白酶体及剪接体等6个关键信号通路。 ③ 候选基因验证：例如涉及抗冻作用的CIRBP和RHOA，在冷冻处理后其mRNA表达显著下调，与转录组数据一致。

2.HSP90对精子冷冻的保护作用

① 活性提升：在添加HSP90的精液稀释液中发现，含0.5 mg/ml或1 mg/ml HSP90蛋白的处理组在冷冻解冻后精子存活率和运动能力显著提高，其中0.5 mg/ml的效果最佳。 ② 推测机制：HSP90可能通过减少冷冻诱导的ATP能量消耗及清除活性氧自由基（ROS），从而保护精子的功能。

讨论与意义

冷冻对精子转录组的影响：

1. 能量代谢的改变：冷冻解冻导致参与线粒体氧化磷酸化的基因显著下调，可能使ATP生成减少，继而影响精子供能和运动能力。
2. 核糖体功能障碍：58个核糖体相关基因的表达受到显著调控，这可能与冷冻应激导致精子结构蛋白合成效率下降有关。
3. 细胞周期紊乱：多个细胞周期调控基因（如Cyclin A1）被冷冻处理抑制提示其潜在的抗冻效应。
4. 剪接体受损：一些精子独特的RNA剪接体基因（如Snrpa1）因冷冻显著下调，可能是影响精子功能的另一潜在机制。

HSP90的保护作用：

1. HSP90蛋白在改善精子抗冻能力方面表现出重要作用，其机制可能包括减少线粒体能量消耗和活性氧清除。
2. 此外，HSP90可能通过激活抗氧化信号通路保护精子膜的完整性，为进一步研究奠定了基础。

研究亮点及展望

1. 本研究首次系统揭示了家禽冷冻精子的转录组特征，突出了抗冻相关基因的重要性。
2. 提出了通过添加重组HSP90蛋白来改善精子冷冻效果的可行性，为优化鸡精子冷冻保存技术提供了重要数据。
3. 后续研究需重点关注RPL29、CIRBP、RHOA等关键基因的功能确认，以及探索HSP90保护精子的具体机制。

研究价值

本文不仅为家禽繁殖生物学研究和基因冷冻技术提供了新视角，还对家禽种质资源保护及提高家禽商业育种效率具有重要应用价值。