高效多重π-FISH彩虹技术：用于多种生物分子的原位检测

作者与研究背景

本文标题为“Highly efficient and robust π-fish rainbow for multiplexed in situ detection of diverse biomolecules”，发表在《Nature Communications》，作者主要来自华中农业大学及其他国际研究机构，包括Yingfeng Tao、Xiaoliu Zhou和Gang Cao等。研究于2023年1月被接受，旨在为单细胞测序和空间多组学研究提供一种高效、多功能的原位检测工具。

近年来，单细胞RNA测序（scRNA-seq）在揭示多细胞生物的细胞异质性方面取得了巨大进展。然而，该技术无法提供细胞空间定位和周围组织微环境信息。荧光原位杂交（FISH）技术能够通过特异性杂交定位核酸，但传统方法在灵敏度、特异性和空间分辨率方面面临诸多挑战，尤其是对于短核酸片段和复杂生物体系的应用。因此，开发新一代高效、鲁棒的FISH技术显得尤为重要。

研究目标

本文的主要目标是开发一种新型的多重原位检测技术——π-FISH彩虹技术，以高效、低背景噪声的方式检测DNA、RNA、蛋白质及神经递质等多种生物分子。此外，结合杂交链反应（HCR），进一步开发了π-FISH+技术，克服传统FISH方法无法检测短核酸片段的局限性。

研究方法与流程

研究团队设计了一种具有高灵敏度和特异性的π-FISH彩虹技术，其核心是通过以下几步实现多重信号的放大和检测：

1. 探针设计
   π-FISH目标探针包含2–4个互补碱基对，形成π形结构以增加杂交稳定性。在次级和三级放大步骤中，分别采用U形放大探针进一步增强信号强度。

2. 工作流程

   • 第一步：目标探针与目标核酸序列结合。
   • 第二步：使用U形次级放大探针。
   • 第三步：采用三级放大探针进一步放大信号。
   • 第四步：使用荧光信号探针对目标区域进行可视化。

3. 数据分析与验证

   • 比较π-FISH与传统方法（如HCR、smFISH等）的灵敏度和背景噪声。
   • 在多种样本（细胞、组织切片、全胚样本）中验证π-FISH的可靠性。
   • 开发了结合HCR的π-FISH+技术，实现短核酸片段的检测。

样本与实验设置

研究团队将π-FISH彩虹技术应用于不同的物种和样本中，包括： - 微生物：如结核分枝杆菌和非洲猪瘟病毒。 - 植物：玉米胚芽切片中Kn1基因的表达。 - 动物：小鼠脑组织中神经元亚型的空间分布，以及斑马鱼胚胎中的基因表达。 - 临床样本：检测前列腺癌患者循环肿瘤细胞（CTCs）中与抗雄激素治疗耐药相关的AR-V7剪接变体。

研究结果

1. 高效性和灵敏度
   π-FISH彩虹技术在灵敏度和特异性上显著优于传统方法。实验结果表明，其荧光信号强度显著高于HCR和smFISH，并在低表达基因（如mTOR）的检测中表现出色。

2. 多重检测能力

   • π-FISH彩虹能够同时检测多种生物分子，包括DNA、RNA和蛋白质。在小鼠大脑皮层中，研究解码了9个兴奋性神经元标志基因和12个抑制性神经元标志基因的空间分布，准确再现了皮层的层特异性表达模式。
   • 在斑马鱼胚胎中，检测了Deltaa和Ntla基因的共表达模式。

3. 短核酸片段检测
   π-FISH+技术结合HCR实现了短核酸片段（如miRNA和剪接变体）的检测：

   • 检测miR-145-5p及其靶向长链非编码RNA MALAT1的共定位。
   • 成功区分并检测了前列腺癌患者CTCs中的AR-V7剪接变体，为临床耐药性诊断提供了新工具。

4. 蛋白质和神经递质检测
   π-FISH彩虹技术能够通过特异性单链DNA标记抗体，检测多种蛋白质及神经递质（如GABA）。

研究意义

1. 技术创新
   π-FISH彩虹技术通过创新的探针设计和多重信号放大，显著提高了原位检测的灵敏度和特异性。

2. 多功能性
   该技术在微生物、植物、动物及临床样本中均表现出广泛的适用性，尤其是在基因剪接变体和miRNA检测中具有独特优势。

3. 临床应用潜力
   π-FISH+技术的开发为癌症等重大疾病的精准诊断和治疗提供了新的工具。

4. 空间组学研究
   π-FISH彩虹为多维度空间组学研究提供了高效平台，可用于解码复杂组织的细胞类型和基因表达模式。

研究展望

π-FISH彩虹和π-FISH+技术的成功开发为多组学研究和临床诊断提供了强有力的工具。未来，研究团队计划进一步提高该技术的通量和兼容性，例如结合原位测序和多轮杂交，以实现更大规模的基因检测。同时，该技术可与钙成像、拉曼成像等技术整合，为解码细胞内生物分子复杂网络提供更多可能性。

本文通过π-FISH彩虹技术的开发和应用展示了现代分子生物学与诊断技术的前沿进展。它不仅为科学研究提供了高效工具，也为临床医学带来了重要突破。