这篇文章标题为“The ROS-producing enzyme NADPH oxidase/RboH is a Ca2+ channel regulated by protons in the eukaryotic kingdom”，发表于2024年8月7日，主要作者均来自首都师范大学，包括Liangyu Liu、Zijian Yang、Yangbo Chen等人，文章发表在公共数据库上，DOI为：https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-4840681/v1，具有开放获取许可（Creative Commons Attribution 4.0）。以下是对该研究的详细解读。

背景与研究目的

活性氧（ROS）广泛存在于动物、植物及真菌等生物中，是许多生理与应激反应中的重要分子信号。NADPH氧化酶（简称NOX或RboH）是ROS生成的关键酶，其功能在植物生长发育及生物、非生物胁迫响应中尤为关键。同时，ROS和钙离子（Ca²⁺）之间的信号联动是细胞信号转导中的核心机制，但研究尚未明确导致ROS与Ca²⁺联动的特定钙通道。本研究通过实验首次发现植物、动物和酵母领域中的NADPH氧化酶不仅在ROS生成中起作用，还兼具钙通道的功能，揭示了NOX/RboH作为钙通道的新特性和调控机制，这一发现为ROS和Ca²⁺信号研究提供了一种新的概念和研究视角。

方法与流程

研究采用了多个实验系统以验证RboH的钙通道功能及其在不同生物中的普遍性。关键实验与流程包括： 1. 植物中的功能观察： - 通过利用带有钙离子指示蛋白的拟南芥突变体（如rbohdaeq）和ROS刺激物如H₂O₂和PAMP（pathogen-associated molecular pattern）因子Flg22，探索ROS引发的细胞钙信号变化。 - 对拟南芥和rbohd突变体植株在不同外源钙浓度（0.1至1.5 mM）下的表型进行比较，验证RboH维持植物生长的钙依赖性。

1. 电生理技术验证RboH通道活性：

   • 利用非洲爪蟾卵母细胞系统结合双电极电压钳（TEVC）记录，测试RboH在不同离子环境下的通道活性。同时还测试了正对照CNGC14和未注射RNA的阴性对照。

2. 验证不同物种的NOX的通道功能：

   • 研究人类（如NOX2、NOX5等）、酵母（YNO1）以及植物（拟南芥和水稻）的不同NOX蛋白跨物种通道功能的一致性。
   • 测试NOX对单价阳离子（K⁺、Na⁺）和二价阳离子（Ca²⁺、Mg²⁺）的选择性。

3. 环境因素调控功能测试：

   • 考察外源钙浓度、环境pH值变化对RboH钙通道功能的影响。
   • 通过拟南芥以不同pH值及钙浓度生长条件下的根伸长实验进一步探讨钙通道功能的生态相关性。

4. 抗病功能实验：

   • 比较RboHD突变株和野生型拟南芥植株在细菌感染（如Pseudomonas syringae pv. tomato，简称Pst DC3000）下的表现，以及在低钙环境下与Flg22诱导治疗后的气孔关闭反应等。

主要结果

1. RboH具有钙通道功能：

   • 通过双电极电压钳实验首次直接证实了拟南芥的RboHD蛋白具有钙通道活性，该通道功能可通过钙诱导的电流响应显示并与正对照CNGC14类似。

2. RboH为非选择性阳离子通道：

   • 进一步实验显示，RboHD不仅对Ca²⁺具有通道活性，还可传输K⁺、Na⁺、Mg²⁺等多种阳离子。

3. NOX家族的钙通道功能具有保守性：

   • 测试发现，除拟南芥RboH，酵母的YNO1及部分人源NOX（如NOX2）也展现出类似钙通道的功能，这表明NOX家族钙通道功能在真核生物中具有广泛保守性。

4. RboH的通道功能受环境pH及外源钙调控：

   • 在酸性环境（pH5.6）下RboH显示显著的钙通道活性，而碱性环境（pH7.4及以上）对通道活性抑制明显。同时RboH的功能依赖足够的外源Ca²⁺浓度，其对植物根生长表现出强烈的钙浓度依赖性。

5. 抗病作用中的钙依赖机制：

   • RboHD突变株对细菌感染的抵御能力显著下降，且在低钙条件下失去气孔关闭或ROS钙波功能，进一步验证了RboHD在免疫抗性中的关键作用。

讨论与意义

1. 揭示NOX/RboH新功能：

   • 传统上，NOX被认为是主要负责生成ROS的氧化酶，而本研究中发现其还具有钙通道功能，该功能对于将ROS和Ca²⁺信号耦合至关重要。这一发现大幅拓展了NOX研究领域，并提供了重新审视其在信号转导及生理调控中作用的新视角。

2. 钙信号与ROS信号整合的核心机制：

   • NOX蛋白同时作为ROS生成酶和钙通道，将ROS-Ca²⁺信号整合为单一通路，这可能是植物长距离伤害信号传导等复杂现象的重要驱动机制。

3. 质子调控的钙通道新概念：

   • 研究表明质子（H⁺）可以直接激活RboHD的钙通道活性，这种质子调控特性在植物钙通道研究领域中尚属首次报道，为质子与钙信号相互作用机制研究提供了重要切入点。

4. 对人类健康与农业生产应用的启发：

   • 在人类健康领域，NOX与神经退行性疾病、癌症等重大疾病强化相关。本研究提供了通过钙通道功能探索NOX在健康与疾病中细胞信号调控机制的新可能。
   • 在农业生产中，钙在作物抗逆和生长调控中的关键作用已有广泛认知，这一发现为开发基于钙信号调控的作物耐逆性提升方案提供了新途径。

研究亮点

• 首次在真核生物中确认NOX/RboH是兼具钙通道功能的ROS生成酶。
• 揭示了植物RboH音激的钙通道功能在pH环境和钙浓度调控下的独特特性。
• 提供了NOX作为信号耦合器整合ROS和钙信号的新机制。
• 通过跨物种研究验证了NOX钙通道功能在真核生物中的广泛保守性。

总结

这项研究首次证实了NADPH氧化酶（NOX/RboH）的钙通道功能，并提出了其作为ROS和Ca²⁺信号整合核心的功能模型。这一突破不仅为ROS和钙信号通路研究提供了新方向，也为跨生物领域的信号整合机制研究奠定了基础，其生物学意义和潜在应用价值非常值得进一步探讨。