本文是一篇关于长期冷冻保存对巨型石斑鱼（Epinephelus lanceolatus）精子转录组影响的原创研究论文，由Xiaoyu Ding、Yongsheng Tian、Yishu Qiu、Pengfei Duan、Xinyi Wang、Zhentong Li、Linlin Li、Yang Liu和Linna Wang等作者共同完成，发表于2024年4月22日的《Genes》期刊上。该研究旨在探讨长期冷冻保存对巨型石斑鱼精子基因表达的影响，揭示冷冻损伤的分子机制。

研究背景

巨型石斑鱼是石斑鱼科中体型最大且稀有的经济鱼类，具有快速生长的特性。由于其雄性和雌性发育不同步，雄性数量较少，精子冷冻保存技术在水产养殖中具有重要意义。冷冻保存不仅有助于保存优良种质资源，还能延长繁殖周期。然而，冷冻损伤不可避免，尤其是对精子形态、运动能力和酶活性的影响。尽管已有研究表明冷冻保存会影响精子的结构和功能，但其分子机制尚不明确。因此，本研究通过转录组分析，比较了新鲜精子和不同冷冻时间（0、23、49和61个月）冷冻精子的基因表达差异，旨在揭示冷冻损伤的分子机制。

研究方法

研究首先从健康的巨型石斑鱼雄性个体中采集精子样本，分别进行新鲜精子和冷冻精子的处理。冷冻精子样本分别来自2020年9月、2018年7月和2017年7月的冷冻保存。冷冻保存采用实验室已有的冷冻方案，冷冻液为15% DMSO + 10% FBS。冷冻后的精子在37°C水浴中解冻，确保冰晶完全融化。

随后，研究使用TRIzol试剂提取总RNA，并通过Illumina HiSeq 6000平台进行转录组测序。测序数据经过过滤和比对后，使用DESeq2进行差异表达基因（DEGs）分析，筛选条件为FDR < 0.05且|log2FC| > 2。通过GO和KEGG功能富集分析，探讨DEGs的生物学功能和信号通路。此外，研究还进行了时间序列表达分析和加权基因共表达网络分析（WGCNA），以揭示基因表达的趋势和核心调控基因。

研究结果

研究共鉴定出1911个差异表达基因（DEGs），其中在0个月与23个月的比较中发现91个DEGs（40个上调，51个下调），在0个月与49个月的比较中发现251个DEGs（182个上调，69个下调），在0个月与61个月的比较中发现1569个DEGs（984个上调，585个下调）。随着冷冻时间的延长，DEGs的数量显著增加，尤其是在61个月的冷冻保存后，DEGs的数量显著增加（p < 0.05）。

GO和KEGG富集分析显示，DEGs显著富集于纤毛组装、代谢过程、MAPK信号通路、细胞凋亡和p53信号通路等生物学过程。时间序列表达分析表明，持续上调的基因模块与细胞凋亡相关的信号通路显著富集。WGCNA分析发现，SCARB1、ODF3、EXOC8和ATP5F1D四个基因与线粒体和鞭毛功能相关，可能在精子冷冻过程中发挥重要作用。

研究结论

研究表明，长期冷冻保存会导致巨型石斑鱼精子的冷冻损伤，具体表现为基因表达的显著变化。冷冻时间越长，精子的基因表达变化越显著，尤其是与细胞凋亡、代谢和免疫相关的基因。研究结果为鱼类精子冷冻损伤的分子机制提供了丰富的数据支持，并为鱼类精子的长期冷冻保存技术提供了参考和评估指标。

研究亮点

1. 首次揭示了长期冷冻保存对巨型石斑鱼精子转录组的影响：通过转录组分析，研究发现了1911个差异表达基因，揭示了冷冻损伤的分子机制。
2. 冷冻时间对精子基因表达的影响显著：随着冷冻时间的延长，差异表达基因的数量显著增加，尤其是在61个月的冷冻保存后。
3. 核心基因的发现：通过WGCNA分析，研究发现了SCARB1、ODF3、EXOC8和ATP5F1D四个核心基因，这些基因与线粒体和鞭毛功能相关，可能在精子冷冻过程中发挥重要作用。

研究意义

该研究不仅为鱼类精子冷冻损伤的分子机制提供了新的见解，还为水产养殖中的精子冷冻保存技术提供了理论依据和技术参考。通过揭示冷冻保存对精子基因表达的影响，研究为优化冷冻保存方案、减少冷冻损伤提供了重要的科学依据。