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本研究的通讯作者是Yiping Qi，来自美国马里兰大学植物科学与景观建筑系（Department of Plant Science and Landscape Architecture, University of Maryland, College Park）。其他主要作者包括Xiaoyu Wang（内蒙古民族大学生命科学与食品工程学院）、Tyson Fang（密歇根大学）、Jason Lu（马里兰大学）和Leena Tripathi（国际热带农业研究所）。该研究于2024年4月3日发表在《Plant Biotechnology Journal》上。
本研究属于植物生物技术领域，特别是植物基因组编辑技术。叶绿体基因组编辑有助于理解叶绿体基因的分子功能，并用于作物性状改良。尽管已有基于DddA毒素的胞嘧啶碱基编辑器（DddA-derived cytosine base editors, DdCBEs）用于线粒体和叶绿体基因组的C-to-T编辑，但这些工具存在局限性。因此，本研究旨在开发新型单体TALE（transcription activator-like effector）连接的碱基编辑器，以实现更广泛的叶绿体基因组编辑。
编辑器设计与构建
研究者开发了两种新型单体TALE连接的胞嘧啶碱基编辑器（monomeric TALE-linked cytosine base editors, mtCBEs）：mtCBE和mtCBE-T。mtCBE基于人类APOBEC3A变体（hA3A-Y130F），而mtCBE-T基于改进的TADA胞嘧啶脱氨酶。此外，研究者还开发了一种双碱基编辑器mtCABE-T，可同时脱氨胞嘧啶和腺嘌呤。这些编辑器针对水稻叶绿体基因组中的三个基因：编码光系统II核心组分的OsPsbA、光系统I核心组分的OsPsbA和30S核糖体亚基RNA组分的Os16SrRNA。
水稻愈伤组织实验
将构建的碱基编辑器（包括mtCBE、mtCBE-T、mtCABE-T、DdCBE和split-TALED对照）在水稻愈伤组织中表达，并通过靶向扩增子深度测序评估编辑效率。结果显示，mtCBE在OsPsbA、OsPsbA和Os16SrRNA靶点的C-to-T编辑效率分别为42.3%、21.6%和19.4%，显著高于DdCBE和mtCBE-T。mtCABE-T不仅实现了C-to-T编辑（效率分别为33.2%、21.3%和5.0%），还实现了A-to-G编辑（效率分别为17.5%、7.2%和7.8%）。
转基因水稻植株实验
在T0代转基因水稻植株中，mtCBE和mtCABE-T在OsPsbA靶点的C-to-T编辑效率分别达到81%和86%。高频编辑导致OsPsbA功能丧失，表现为白化表型。mtCBE-T编辑效率较低，未观察到白化表型。在Os16SrRNA靶点，mtCBE和mtCABE-T的C-to-T编辑效率也高达80%。
编辑谱分析
研究者分析了不同编辑器的编辑谱。DdCBE偏好编辑50-TC序列中的胞嘧啶，而mtCBE和mtCABE-T在更广泛的序列背景下实现了高效编辑。此外，mtCBE和mtCABE-T在间隔区上下游也实现了碱基编辑，表明其编辑范围更广。
脱靶效应分析
在OsPsbA靶点，mtCBE和mtCABE-T在四个候选脱靶位点中的两个诱导了少量脱靶突变，表明TALE结合位点序列和编辑器表达水平均会影响脱靶编辑结果。
本研究开发了两种新型单体TALE连接的碱基编辑器mtCBE和mtCABE-T，显著提高了叶绿体基因组编辑的效率和范围。这些工具不仅为研究叶绿体基因功能提供了新方法，还为作物性状改良提供了有力工具。特别是mtCABE-T作为一种高效的双碱基编辑器，可同时实现C-to-T和A-to-G编辑，具有广泛的应用潜力。此外，本研究还验证了OsPsbA在光合作用中的关键作用，为相关研究提供了重要参考。
本研究还提供了详细的编辑谱和脱靶效应分析数据，为未来优化碱基编辑器提供了重要参考。此外，研究者还讨论了mtCABE-T在蛋白质进化中的潜在应用价值，表明其可作为一种高密度靶向诱变工具。