本研究由肖胜华、董贤镘、彭鑫、李安子、闭兆福、廖铭静、黄礼豪、管倩倩、胡琴和朱龙付等作者共同完成，分别来自广西大学农学院/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室、华中农业大学/作物遗传改良国家重点实验室以及华中农业大学/湖北洪山实验室。该研究于2024年发表在《作物学报》（Acta Agronomica Sinica）第50卷第10期，题为《转录因子GhWRKY41促进水杨酸合成增强棉花对黄萎病菌的抗性》。研究得到了国家自然科学基金项目（32301880, 32230076）和湖北洪山实验室基金项目（2021HSZD006）的资助。

研究背景与目的

棉花是我国重要的经济作物，但其产量和品质常受到黄萎病菌（Verticillium dahliae）的严重威胁。黄萎病是一种由真菌引起的病害，能够导致棉花植株的叶片黄化、萎蔫甚至死亡，严重影响棉花的产量和质量。因此，挖掘棉花抗黄萎病相关基因并解析其分子机制，对于加速棉花抗病育种进程具有重要意义。

前期研究发现，WRKY基因家族中的GhWRKY41在多个抗病棉花品种中受黄萎病菌诱导显著上调表达，并通过激活苯丙烷代谢途径增强棉花对黄萎病菌的抗性。然而，GhWRKY41在棉花抗病中的具体分子机制尚未完全阐明。本研究旨在进一步探讨GhWRKY41在棉花抗黄萎病中的作用机制，特别是其与水杨酸（Salicylic Acid, SA）合成及信号转导通路的关系。

研究方法与流程

本研究主要分为以下几个步骤：

1. GhWRKY41的诱导表达模式分析
   通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术，分析了GhWRKY41在不同激素处理（SA、Me-JA和H2O2）下的表达模式。结果显示，GhWRKY41在SA、Me-JA和H2O2处理下均显著上调表达，尤其是在SA处理6小时后表达量显著增加。

2. 病毒介导的基因沉默（VIGS）验证GhWRKY41的抗病功能
   利用VIGS技术在陆地棉品种‘Jin668’中沉默GhWRKY41基因，结果显示，沉默GhWRKY41后，棉花对黄萎病菌的抗性显著降低，表现为叶片黄化、萎蔫等症状加重，病情指数显著升高。

3. GhWRKY41转基因棉花株系的SA含量测定
   通过高效液相色谱（HPLC）技术，测定了GhWRKY41超表达和干涉棉花株系中的SA含量。结果显示，GhWRKY41超表达株系中的SA含量显著增加，而干涉株系中的SA含量显著减少。

4. SA合成及信号转导基因的表达分析
   通过RT-qPCR技术，检测了GhWRKY41转基因株系中SA合成基因（GhSID2）及SA信号转导基因（GhNPR1、GhPR1、GhPR5）的表达水平。结果显示，这些基因在GhWRKY41超表达株系中显著上调表达，而在干涉株系中显著下调表达。

5. 染色质免疫共沉淀（ChIP-qPCR）和双荧光素酶报告基因试验
   通过ChIP-qPCR和双荧光素酶报告基因试验，验证了GhWRKY41能够结合并激活GhSID2、GhPR1和GhPR5基因的启动子，从而促进这些基因的表达。

6. 外施SA对棉花抗病性的影响
   通过外施不同浓度的SA溶液，验证了SA能够显著增强棉花对黄萎病菌的抗性。结果显示，SA处理后的棉花植株表现出更强的抗病性，病情指数显著降低。

研究结果

1. GhWRKY41的沉默削弱了棉花对黄萎病菌的抗性
   通过VIGS技术沉默GhWRKY41后，棉花植株对黄萎病菌的抗性显著降低，病情指数显著升高，表明GhWRKY41在棉花抗黄萎病中具有重要作用。

2. GhWRKY41促进SA的合成
   GhWRKY41超表达株系中的SA含量显著增加，而干涉株系中的SA含量显著减少，表明GhWRKY41能够促进棉花中SA的合成。

3. GhWRKY41激活SA合成及信号转导基因的表达
   RT-qPCR结果显示，GhWRKY41超表达株系中SA合成基因（GhSID2）及SA信号转导基因（GhNPR1、GhPR1、GhPR5）的表达水平显著上调，而在干涉株系中显著下调。ChIP-qPCR和双荧光素酶报告基因试验进一步证实，GhWRKY41能够结合并激活这些基因的启动子。

4. 外施SA增强棉花对黄萎病菌的抗性
   外施SA后，棉花植株对黄萎病菌的抗性显著增强，病情指数显著降低，表明SA在棉花抗黄萎病中具有重要作用。

研究结论

本研究揭示了GhWRKY41通过促进SA合成及信号转导通路，增强棉花对黄萎病菌的抗性。具体而言，GhWRKY41能够结合并激活SA合成基因（GhSID2）及SA信号转导基因（GhPR1、GhPR5）的启动子，从而促进SA的合成和信号转导，最终增强棉花对黄萎病菌的抗性。这一发现不仅完善了WRKY基因在植物抗病中的调控网络，还为棉花抗病育种提供了重要的候选基因和理论基础。

研究亮点

1. GhWRKY41的多重抗病功能
   本研究首次揭示了GhWRKY41不仅通过苯丙烷代谢途径增强棉花抗病性，还通过SA合成及信号转导通路进一步增强抗病性，表明GhWRKY41在棉花抗病中具有多重功能。

2. SA在棉花抗黄萎病中的重要作用
   本研究通过外施SA验证了SA在棉花抗黄萎病中的重要作用，为未来利用SA进行棉花抗病育种提供了理论依据。

3. 新颖的实验方法
   本研究采用了ChIP-qPCR和双荧光素酶报告基因试验等先进技术，验证了GhWRKY41对SA合成及信号转导基因的调控作用，为类似研究提供了方法学参考。

研究意义

本研究不仅揭示了GhWRKY41在棉花抗黄萎病中的分子机制，还为棉花抗病育种提供了重要的候选基因和理论基础。未来，基于GhWRKY41的抗病机制，可以通过基因编辑或转基因技术创制抗黄萎病的棉花新品种，从而减少黄萎病对棉花产业的危害，提高棉花的产量和品质。