本文由Maoze Wang、Ge Yan、Qiyao Xiao、Nan Zhou、Hao-Ran Chen、Wei Xia和Lihua Peng等作者共同完成，研究团队主要来自浙江大学药学院、浙江大学金华研究院以及澳门科技大学中药质量研究国家重点实验室。该研究于2023年发表在《Small Science》期刊上，题为“Iontophoresis-Driven Microneedle Arrays Delivering Transgenic Outer Membrane Vesicles in Program that Stimulates Transcutaneous Vaccination for Cancer Immunotherapy”。

研究背景

皮肤作为人体最大的器官，含有丰富的抗原呈递细胞（Antigen-Presenting Cells, APCs），如树突状细胞（Dendritic Cells, DCs），具有通过经皮免疫（Transcutaneous Immunization, TCI）启动免疫治疗的潜力。TCI主要通过激活APCs并促使其迁移至淋巴结，从而增强主要组织相容性复合物I类（MHC I）限制性抗原呈递，进而引发强烈的细胞免疫反应。然而，经皮递送抗原和趋化因子以激活DCs并引导其迁移至淋巴结面临两大挑战：一是皮肤角质层（Stratum Corneum, SC）形成的屏障阻碍了大分子蛋白质的渗透；二是缺乏刺激时，APCs对蛋白质的摄取和迁移能力有限，难以诱导足够的MHC I类抗原呈递。目前大多数策略仅递送抗原，有时与化学佐剂一起递送，但效果有限。

研究目标

本研究旨在开发一种简单、高效且安全的经皮疫苗接种平台，通过离子导入（Iontophoresis, IP）驱动的微针阵列（Microneedle Arrays, MNs）递送转基因外膜囊泡（Outer Membrane Vesicles, OMVs），以增强抗原和趋化因子的经皮递送效率，从而启动经皮免疫反应，用于癌症免疫治疗。

研究方法

1. OMVs的制备与表征：通过基因工程技术将编码gp100和CCL21的质粒DNA（pdnas）转化到大肠杆菌（E. coli）中，分别制备分泌gp100和CCL21的OMVs（gomv和comv）。通过透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）对OMVs的形态、粒径和zeta电位进行表征。

2. 微针阵列的制备与优化：使用聚甲基丙烯酸缩水甘油酯（PGMA）制备多孔微针阵列，并将gomv和comv分别加载到微针中。通过扫描电子显微镜（SEM）和能量色散谱（EDS）分析微针的结构和药物负载能力。优化微针的孔隙率以提高药物负载量。

3. 离子导入驱动的微针系统：将加载gomv和comv的微针分别与空白微针连接，形成离子导入驱动的微针系统（ipmn-g和ipmn-c）。通过体外实验评估离子导入对OMVs释放和皮肤渗透的促进作用。

4. 体外细胞摄取与分布：通过流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）研究ipmn-g和ipmn-c递送的OMVs在骨髓来源的DCs（BMDCs）中的摄取和分布机制。

5. 体内抗肿瘤效果评估：在小鼠黑色素瘤模型中评估ipmn-gc的抗肿瘤效果。通过测量肿瘤体积、生存率和免疫细胞浸润等指标，验证ipmn-gc的免疫治疗效果。

6. 生物安全性评估：通过监测小鼠体重变化和组织病理学分析，评估ipmn-gc的生物安全性。

研究结果

1. OMVs的制备与表征：成功制备了gomv和comv，其平均粒径分别为93.59 nm和98.12 nm，zeta电位分别为-19.5 mV和-18.1 mV。Western blot和ELISA检测证实gomv和comv中分别含有gp100和CCL21蛋白。

2. 微针阵列的优化：优化后的微针孔隙率为50.23%，药物负载量达到20 μg/阵列。微针的机械强度足以穿透小鼠皮肤，且离子导入显著提高了OMVs的释放效率。

3. 离子导入驱动的微针系统：离子导入显著增强了OMVs的皮肤渗透能力，渗透深度达到800 μm。ipmn-g和ipmn-c分别显著提高了gp100和CCL21的经皮递送效率。

4. 细胞摄取与分布：ipmn-g递送的gomv在BMDCs中的摄取率随时间增加，9小时达到22.7%。CLSM观察显示gomv能够逃逸溶酶体，进入细胞质中诱导免疫反应。

5. 体内抗肿瘤效果：ipmn-gc显著抑制了小鼠黑色素瘤的生长，并提高了小鼠的生存率。免疫组化分析显示，ipmn-gc显著降低了肿瘤引流淋巴结中黑色素瘤标志物的表达。

6. 生物安全性：ipmn-gc在小鼠体内表现出良好的生物安全性，未观察到明显的毒性或副作用。

结论

本研究开发了一种基于离子导入驱动的微针阵列系统（ipmn-gc），用于经皮递送抗原和趋化因子，成功启动了经皮免疫反应，显著抑制了小鼠黑色素瘤的生长和转移。ipmn-gc系统具有高效、安全的特点，为癌症免疫治疗提供了一种新的非侵入性递送平台。

研究亮点

1. 创新性递送系统：首次将离子导入驱动的微针阵列与转基因OMVs结合，实现了抗原和趋化因子的高效经皮递送。
2. 显著的抗肿瘤效果：ipmn-gc显著抑制了小鼠黑色素瘤的生长，并提高了生存率。
3. 良好的生物安全性：ipmn-gc在小鼠体内表现出良好的生物相容性，未观察到明显的毒性或副作用。

研究意义

本研究为癌症免疫治疗提供了一种新的经皮疫苗接种策略，具有广泛的应用前景。ipmn-gc系统不仅可用于黑色素瘤的治疗，还可应用于其他皮肤相关疾病的免疫治疗。