本文由Ling Li、Mizuho Fukunaga-Kalabis和Meenhard Herlyn共同撰写，发表于2011年8月的《Journal of Visualized Experiments》（JoVE）期刊。研究团队来自The Wistar Institute的分子与细胞肿瘤发生项目组。该研究的主要目的是开发一种三维（3D）人类皮肤重建模型，用于研究正常皮肤和黑色素瘤（melanoma）的进展。
学术背景
传统的皮肤生物学研究多采用二维（2D）单层培养模型，然而越来越多的证据表明，细胞在三维细胞外基质（extracellular matrix, ECM）中的行为与在2D环境中存在显著差异。尽管小鼠模型被广泛用于研究组织形态发生，但小鼠与人类皮肤在细胞结构和生理功能上存在显著差异，尤其是黑色素细胞（melanocytes）在小鼠皮肤中主要位于毛囊内，而在人类皮肤中则主要位于表皮基底层。因此，直接从小鼠模型推断人类皮肤的研究结果存在局限性。近年来，3D人类皮肤重建模型的发展为研究细胞-基质和细胞-细胞相互作用提供了新的工具。这种模型由嵌入胶原I基质的成纤维细胞构成的“真皮层”、分层的角质形成细胞（keratinocytes）构成的“表皮层”以及分隔表皮与真皮的功能性基底膜（basement membrane）组成。该模型能够模拟人类皮肤中黑色素细胞的稳态和黑色素瘤的进展过程。
研究流程
研究的主要流程包括以下几个步骤：
- 无细胞层制备：将10x EMEM、L-谷氨酰胺、胎牛血清（FBS）、碳酸氢钠和牛胶原I混合，置于冰上，加入组织培养托盘的每个插入孔中，室温孵育30分钟使凝胶固化。
- 成纤维细胞处理：用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化培养瓶中的成纤维细胞，用含10% FBS的DMEM中和，离心后重悬细胞。对于真皮干细胞（dermal stem cells），收集6600个真皮球体（dermal spheres）。
- 细胞层制备：将10x EMEM、L-谷氨酰胺、FBS、碳酸氢钠、牛胶原I和成纤维细胞悬液混合，加入每个无细胞层涂覆的插入孔中，37°C孵育45分钟使凝胶固化，随后加入含10% FBS的DMEM，孵育4天。
- 洗涤：用含1%透析FBS的HBSS洗涤插入孔内外，孵育1小时。
- 皮肤重建培养基制备：分别配制正常黑色素细胞、真皮干细胞和黑色素瘤细胞的培养基。
- 角质形成细胞和黑色素细胞/黑色素瘤细胞处理：用0.05%胰蛋白酶/EDTA消化角质形成细胞和黑色素细胞/黑色素瘤细胞，重悬于皮肤重建培养基I中。
- 细胞接种：将角质形成细胞和黑色素细胞/黑色素瘤细胞混合悬液滴加到每个插入孔中，孵育2天。
- 培养基更换：更换为皮肤重建培养基II，孵育2天，随后更换为皮肤重建培养基III，暴露于空气中，每两天更换一次培养基，直至第18天。
- 皮肤重建收获：在第18天收获皮肤重建样本，进行石蜡切片或冷冻切片处理。
- 小鼠移植：将皮肤重建样本移植到SCID无毛小鼠背部，观察其生长和分化。
主要结果
- 正常黑色素细胞和真皮干细胞的皮肤重建：皮肤重建模型能够模拟人类皮肤的分层结构，黑色素细胞位于基底膜并与多个角质形成细胞通过树突状延伸进行通信。真皮干细胞能够迁移到表皮并分化为黑色素细胞。
- 黑色素瘤的皮肤重建：不同阶段的黑色素瘤细胞在3D模型中表现出与体内相似的行为。RGP（径向生长期）黑色素瘤细胞主要在表皮内增殖，VGP（垂直生长期）黑色素瘤细胞侵入真皮，而转移性黑色素瘤细胞则深入真皮层。
结论与意义
该研究开发的3D皮肤重建模型为研究正常皮肤和黑色素瘤的进展提供了重要的工具。与传统的2D培养模型相比，3D模型能够更好地模拟体内环境，揭示细胞-基质和细胞-细胞相互作用的复杂性。此外，该模型还可用于药物筛选和基因功能研究，为黑色素瘤的治疗提供了新的研究方向。
研究亮点
- 创新性：首次开发了能够模拟人类皮肤分层结构和黑色素瘤进展的3D重建模型。
- 应用价值：该模型不仅可用于基础研究，还可用于药物筛选和临床前试验，具有广泛的应用前景。
- 技术突破：通过真皮干细胞的迁移和分化，揭示了黑色素细胞生成的机制，为干细胞研究提供了新的视角。
其他有价值的内容
研究还探讨了3D模型在基因功能研究和药物筛选中的应用潜力，为未来的黑色素瘤研究提供了新的思路。此外，通过移植到小鼠体内，研究人员能够长期观察细胞表型的变化，进一步验证了该模型的可靠性和实用性。
总之，这项研究为皮肤生物学和黑色素瘤研究提供了重要的工具和方法，具有显著的学术和应用价值。