本文介绍了一项关于在小鼠大脑、肝脏和心脏中实现高效Prime Editing（PE）的研究，该研究由Jessie R. Davis、Samagya Banskota、Jonathan M. Levy等作者共同完成，并于2024年2月发表在《Nature Biotechnology》期刊上。该研究的主要目标是开发一种高效的腺相关病毒（AAV）介导的Prime Editing系统，以解决基因编辑在体内递送的瓶颈问题，并推动遗传疾病的研究和治疗。

研究背景

Prime Editing（PE）是一种精确的基因编辑技术，能够在不依赖双链断裂的情况下，实现几乎任何类型的碱基替换、小片段插入或删除。与传统的CRISPR-Cas9系统相比，PE减少了不必要的插入、删除、染色体异常等副作用。然而，PE在体内的应用受到递送效率的限制，尤其是AAV的包装容量有限（约4.7 kb），而PE的编码序列较长（约6.3 kb），无法直接通过单个AAV递送。因此，研究团队开发了一种双AAV系统，通过将PE蛋白分成两部分，分别包装到两个AAV中，实现了高效的体内基因编辑。

研究流程

研究团队首先设计了多种PE蛋白的分割方案，并通过体外实验筛选出效率最高的分割位点（1024-cfn和844-cfn）。随后，他们优化了AAV的基因组结构，引入了增强PE表达的启动子（如cbh启动子）和稳定的Prime Editing引导RNA（pegRNA），并测试了不同编辑类型在体内的效率。研究还探讨了DNA错配修复（MMR）对PE效率的影响，发现通过设计能够逃避MMR的编辑可以显著提高编辑效率。

在体内实验中，研究团队通过脑室内注射（ICV）和系统注射（RO）两种方式将AAV递送到小鼠的不同器官中，评估了PE在大脑、肝脏和心脏中的编辑效率。结果显示，优化的双AAV系统（v3em PE-AAV）在小鼠大脑中的编辑效率高达42%，肝脏中为46%，心脏中为11%。此外，研究团队还成功在体内安装了与阿尔茨海默病和冠状动脉疾病相关的保护性突变，证明了PE在治疗遗传疾病中的潜力。

主要结果

1. 大脑中的编辑效率：通过脑室内注射，研究团队在小鼠大脑中实现了高达42%的编辑效率，尤其是在星形胶质细胞中成功安装了与阿尔茨海默病相关的保护性突变（APOE3 R136S）。
2. 肝脏中的编辑效率：通过系统注射，研究团队在小鼠肝脏中实现了46%的编辑效率，并成功安装了与冠状动脉疾病相关的保护性突变（PCSK9 Q152H），显著降低了血浆中的低密度脂蛋白（LDL）胆固醇水平。
3. 心脏中的编辑效率：在心脏中，编辑效率达到了11%，这是首次在心脏中实现PE编辑。
4. 脱靶效应和毒性评估：研究团队通过Circle-seq技术评估了PE的脱靶效应，结果显示没有检测到明显的脱靶编辑。此外，血清学和组织学分析表明，PE-AAV系统没有引起明显的肝毒性。

结论

该研究开发了一种高效的AAV介导的Prime Editing系统，能够在多个小鼠器官中实现高水平的基因编辑。这一系统为遗传疾病的研究和治疗提供了新的工具，尤其是在大脑、肝脏和心脏中的应用具有重要的临床意义。研究还表明，通过优化PE蛋白的表达和pegRNA的稳定性，可以显著提高体内编辑效率。

研究亮点

1. 高效的体内编辑：研究团队开发的v3em PE-AAV系统在小鼠大脑、肝脏和心脏中实现了迄今为止最高的编辑效率。
2. 保护性突变的安装：研究成功在体内安装了与阿尔茨海默病和冠状动脉疾病相关的保护性突变，展示了PE在治疗遗传疾病中的潜力。
3. 无脱靶效应和低毒性：研究证明PE-AAV系统在体内具有高度的特异性，且未引起明显的毒性反应。

研究意义

该研究为Prime Editing在体内的应用提供了重要的技术突破，推动了基因编辑技术在基础研究和临床治疗中的应用。通过优化AAV递送系统，研究团队为未来开发更安全、更高效的基因疗法奠定了基础。