本文介绍了一项由Han Zhang等人发表在《Nucleic Acids Research》期刊上的研究，题为“Self-delivering, chemically modified CRISPR RNAs for AAV co-delivery and genome editing in vivo”。该研究由美国马萨诸塞大学医学院RNA治疗研究所、哈佛大学、麻省理工学院Broad研究所等多个机构的科研团队合作完成，于2023年11月30日在线发表。

研究背景

CRISPR-Cas9基因编辑技术近年来在生物医学研究中取得了重大突破，并展现出巨大的治疗潜力。然而，CRISPR系统的RNA引导特性在体内递送方面带来了挑战。未修饰的单链RNA（ssRNA）极易被核酸酶降解，限制了其在体内的应用。化学修饰已被证明可以增强核酸的稳定性、分布、细胞摄取和安全性，尤其是在寡核苷酸治疗领域取得了显著成功。本研究旨在通过化学修饰CRISPR引导RNA（crRNA），实现其在体内的自我递送，从而避免使用脂质纳米颗粒（LNP）等递送载体。

研究流程

研究团队首先设计并合成了多种化学修饰的crRNA，并通过电穿孔将其递送至稳定表达Cas9蛋白和tracrRNA的细胞系中，评估其编辑活性。研究发现，部分修饰的crRNA（如C20）在多个靶点上表现出较高的编辑效率，但其稳定性较差。为了增强C20的稳定性，研究团队设计了一种名为“保护寡核苷酸”（protecting oligo, P.O.）的短链、全修饰寡核苷酸，其序列与C20的核糖区域互补。P.O.通过与C20形成双链结构，显著提高了C20的稳定性和编辑效率。

进一步的研究表明，P.O.不仅可以通过电穿孔递送，还可以通过被动摄取进入细胞，并在细胞内形成有效的CRISPR-Cas9复合物。此外，P.O.还可以与多种生物共轭物（如胆固醇、DHA等）结合，增强crRNA的细胞摄取和体内分布。研究团队通过在小鼠中枢神经系统（CNS）和肝脏中的实验，验证了这种自我递送crRNA的可行性。

主要结果

1. P.O.增强crRNA的稳定性和活性：P.O.显著提高了C20的稳定性，使其在血清中能够抵抗核酸酶的降解。同时，P.O.与C20形成的复合物在多个靶点上表现出更高的编辑效率。
2. P.O.支持被动摄取和生物共轭：研究发现，未配制的C20/P.O.复合物可以通过被动摄取进入细胞，并在细胞内形成有效的CRISPR-Cas9复合物。此外，P.O.可以与多种生物共轭物结合，增强crRNA的细胞摄取和体内分布。
3. 体内基因编辑：研究团队通过AAV（腺相关病毒）与crRNA的共递送，成功在小鼠肝脏和中枢神经系统中实现了体内基因编辑。特别是在CNS中，DHA和胆固醇共轭的P.O.显著提高了crRNA的分布和编辑效率。

结论

本研究提出了一种通过化学修饰和P.O.增强crRNA稳定性和活性的策略，实现了CRISPR-Cas9系统的自我递送。这种方法不仅避免了使用LNP等递送载体，还为多靶点编辑、时空控制编辑事件以及AAV载体的失活提供了新的可能性。尽管目前的编辑效率相对较低，但通过优化剂量方案和进一步改进P.O.的设计，有望在未来实现更高的编辑效率和更广泛的组织分布。

研究亮点

1. 创新性的P.O.设计：P.O.通过与crRNA形成双链结构，显著提高了crRNA的稳定性和编辑效率，同时不影响Cas9的活性。
2. 自我递送的crRNA：研究首次展示了未配制的化学修饰crRNA可以通过被动摄取进入细胞，并在体内实现基因编辑。
3. 多靶点编辑和时空控制：通过AAV与crRNA的共递送，研究团队展示了在多个组织中实现基因编辑的潜力，并为未来的治疗应用提供了新的思路。

未来展望

未来的研究可以进一步优化P.O.的化学修饰和共轭物设计，探索新的递送方式和剂量方案，以提高编辑效率和安全性。此外，结合AAV载体的改进，有望在更多组织中实现高效的基因编辑，为CRISPR-Cas9系统的临床应用开辟新的途径。