Chang-sheng Zhan, Jia Chen, Jing Chen等学者发表了一篇题为《CaMK4-Dependent Phosphorylation of Akt/MTOR Underlies Th17 Excessive Activation in Experimental Autoimmune Prostatitis》的研究论文，发表于2020年《The FASEB Journal》。此研究主要由安徽医科大学第一附属医院泌尿外科及相关单位组成团队完成，研究目的是探索Th17细胞在慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）的发展机制中可能扮演的重要角色，并揭示CaMK4（钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV）如何通过Akt/mTOR信号通路影响Th17细胞的过度活化。

研究背景

CP/CPPS是一种非感染性但表现为生殖泌尿系统疼痛的复杂综合征，其病理机制尚不完全清楚。目前推测，Th17细胞驱动的自身免疫反应可能是CP/CPPS的一大病因。研究表明，Th17细胞及其分泌的IL-17A等细胞因子在多种自身免疫性疾病中起到关键作用。然而，就Th17细胞在CP/CPPS中的具体作用，当前科学界仍存在争议。此外，尽管已有研究揭示了CaMK4调控其它免疫细胞的分化及因果机制，但CaMK4在实验性自身免疫性前列腺炎（EAP）中对Th17细胞产生的具体作用仍不明确。因此，本研究旨在探究由CaMK4调控的信号通路是否以及如何影响Th17细胞介导的自身免疫平衡紊乱。

研究方法与实验流程

研究团队开展了一系列体内和体外实验来验证假说，并采用了以下基本流程：

1. 动物模型的建立及分组

研究选用了非肥胖糖尿病（NOD）小鼠，这类小鼠对实验性自身免疫性前列腺炎有遗传易感性。通过将大鼠前列腺抗原与完全弗氏佐剂（CFA）混合后，在第0天和第14天对小鼠皮下注射，成功建立EAP动物模型。小鼠于第42天被过量氯化合物麻醉并处死以采集样本。

2. 行为分析

通过Von Frey力丝检查测定刺激前列腺周围腹部区域时的疼痛敏感反应，量化EAP小鼠的疼痛行为特征。

3. 组织学分析与免疫组化测试

取出前列腺组织，进行HE染色和病理形态观察，同时利用特定染色标记Th17细胞标志物（IL-17A）、巨噬细胞标志物（F4/80）和中性粒细胞标志物（LY6G），评估与炎症相关的组织变化。

4. 流式细胞术与细胞因子检测

通过流式细胞术（FCM）分析脾脏淋巴细胞中Th17细胞的比例，检测IL-17A和相关细胞因子在不同组织中的水平（如脾脏、血清和前列腺组织），并进行抗原回忆实验进一步测定前列腺抗原特异性Th17细胞的增殖情况。

5. 信号通路及分子机制研究

利用药理（CaMK4抑制剂KN-93）和遗传手段（shRNA敲低CaMK4）抑制CaMK4活性，并开展了以下分析： - 研究CaMK4的磷酸化机制与Th17分化的关系； - 检测在Th17极化与分化过程中Akt/mTOR信号通路的激活以及相关蛋白（如Raptor、Rictor）的表达和磷酸化水平； - 应用2-APB（一种IP3受体拮抗剂）研究CaMK4磷酸化对细胞内钙离子浓度变化的依赖性。

6. Ca2+浓度动态变化检测

利用荧光染料（Fluo-3AM）和共聚焦显微镜定量测量小鼠Th17细胞的细胞内钙离子浓度，并在ATP刺激条件下记录Ca2+释放和重新补充的动态变化。

核心研究结果

1. EAP模型的建立

EAP小鼠表现出显著的前列腺组织炎症表型和疼痛敏感特征。脾脏中的Th17细胞比例和IL-17A表达显著上升，前列腺组织中IL-17A、F4/80、LY6G标记阳性细胞显著增加。

2. IL-17A对EAP病理改变的关键作用

通过中和抗体阻断IL-17A，小鼠CP/CPPS的主要症状显著减轻，如前列腺组织炎症改善、Th17细胞比例下降、疼痛反应减轻以及相关因子（CXCL1、CXCL2）和中性粒细胞浸润减少。这表明，IL-17A介导了炎症和疼痛的发生与维持。

3. CaMK4的关键作用

体外实验显示，在Th17细胞分化过程中，CaMK4的磷酸化水平显著上调，且CaMK4在Th17细胞中的表达高于Th1、Th2和Treg细胞。抑制CaMK4活性后，Th17细胞的分化受到抑制，相关细胞因子IL-17A和IL-22的产生减少，RORγt（Th17分化关键转录因子）表达下降。

4. 钙离子与CaMK4的关系

EAP小鼠Th17细胞内的基础钙浓度和ATP诱导的钙释放显著高于对照组，并在Ca2+的回补阶段维持更高的浓度水平。这表明Th17细胞的异常活化强度可能受到细胞内钙信号的调控。使用2-APB显著降低了Ca2+浓度和CaMK4的磷酸化水平，从而限制了Th17细胞的分化。

5. Akt/mTOR信号通路

CaMK4抑制药物KN-93和shRNA敲低均导致Akt/mTOR信号通路关键蛋白的磷酸化水平下降，表明CaMK4通过这一信号通路促进了Th17细胞的分化和炎症性细胞因子的分泌。

研究结论及意义

研究表明，过度活化的Th17细胞在EAP的发病机制中起到核心作用，而CaMK4通过调控Ca2+信号和Akt/mTOR通路在这一过程中占据重要位置。针对CaMK4的治疗干预，可有效缓解因CP/CPPS引起的慢性炎症反应和相关疼痛症状。因此，CaMK4可能成为未来抗疫苗诱导型或其他与Th17相关的自身免疫性前列腺炎治疗的新靶点。

研究亮点与展望

1. 揭示了CaMK4的独特作用，其作为钙信号调节与Th17分化桥梁的机制首次在EAP中被明确。
2. 确立了CaMK4-Akt/mTOR-IL-17A轴在Th17细胞异常激活中的关键作用，为相关疾病治疗开辟了新思路。
3. 试验验证了CaMK4抑制剂的潜在疗效，为药物开发提供了可靠依据。

此研究不仅厘清了Th17细胞在CP/CPPS中的致病机理，还为探索更精准的免疫抑制疗法提供了重要指引。