这篇文档属于类型a，即报告了一项原创性研究。以下是对该研究的学术报告：

主要作者及研究机构

本研究由Yanhui Liang、Jingke Xie、Quanjun Zhang、Xiaomin Wang等多名作者共同完成，他们分别来自中国科学院广州生物医药与健康研究院、新西兰-中国生物医学与健康联合实验室、中国科学院大学、海南三亚猪资源研究所等多个研究机构。该研究于2022年5月11日在线发表在《Nucleic Acids Research》期刊上，文章标题为“AGBE: A dual deaminase-mediated base editor by fusing CGBE with ABE for creating a saturated mutant population with multiple editing patterns”。

学术背景

本研究属于基因编辑领域，特别是基于CRISPR/Cas9系统的碱基编辑技术。基因编辑技术近年来取得了显著进展，尤其是单碱基编辑器的开发，如胞嘧啶碱基编辑器（CBE, Cytosine Base Editor）和腺嘌呤碱基编辑器（ABE, Adenine Base Editor），它们分别可以实现C-to-T和A-to-G的碱基转换。然而，这些单碱基编辑器只能实现一种类型的碱基替换，限制了其在饱和突变筛选中的应用。饱和突变是指通过基因编辑技术在特定基因中引入尽可能多的突变，以研究突变与表型之间的关系。

为了解决这一问题，研究人员开发了一种新型的双脱氨酶介导的碱基编辑系统，称为AGBE（Adenine and Glycosylase Base Editor）。AGBE通过将CGBE（Glycosylase Base Editor）与ABE融合，能够同时引入四种类型的碱基转换（C-to-G、C-to-T、C-to-A和A-to-G）以及插入/缺失（indels）突变。这一系统为研究单核苷酸变异（SNVs）和插入/缺失突变的功能和后果提供了高效的工具。

研究流程

本研究主要包括以下几个步骤：

1. AGBE系统的构建与优化
   研究人员首先构建了多个版本的AGBE系统，包括AGBE-1、AGBE-2、AGBE-3、AGBE-4以及miniAGBE-2、miniAGBE-3和miniAGBE-4。这些版本的主要区别在于使用的脱氨酶类型和结构优化。例如，AGBE-1使用了大鼠来源的胞嘧啶脱氨酶（rat APOBEC1），而AGBE-2则使用了人类来源的胞嘧啶脱氨酶（human APOBEC3A），以提高C-to-T的编辑效率。此外，研究人员还通过去除尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）结构域，构建了更小的miniAGBE版本，以提高转染效率。

2. AGBE系统的验证与比较
   研究人员在人类胚胎肾细胞（HEK293）中验证了不同版本AGBE的编辑效率。通过设计多个单导RNA（sgRNA）靶向不同的内源基因，研究人员利用Sanger测序和扩增子深度测序（Amplicon Deep Sequencing）检测了碱基编辑的频率和编辑窗口。结果显示，AGBE-2、AGBE-3和AGBE-4能够同时实现A-to-G和C-to-G/T/A的碱基转换，且编辑效率与ABE相当。此外，AGBE系统还显著增加了插入/缺失突变的频率。

3. AGBE在猪胚胎和原代细胞中的应用
   为了验证AGBE系统在哺乳动物胚胎中的有效性，研究人员将miniAGBE-4 mRNA与sgRNA共同注射到猪的孤雌激活胚胎中。结果显示，miniAGBE-4在猪胚胎中表现出高效的碱基编辑能力，且未显著影响胚胎的发育。此外，研究人员还在猪原代成纤维细胞（PFFs）中验证了miniAGBE的编辑效率，结果显示其能够同时引入A-to-G和C-to-T的碱基转换。

4. AGBE的脱靶效应分析
   为了评估AGBE系统的安全性，研究人员进行了全基因组测序（WGS）和RNA测序（RNA-seq），以检测miniAGBE-4在DNA和RNA水平上的脱靶效应。结果显示，miniAGBE-4在DNA和RNA水平上均未显著增加脱靶编辑的频率，表明其具有较高的安全性。

5. AGBE在人类细胞中的应用
   为了展示AGBE系统在饱和突变筛选中的应用，研究人员利用miniAGBE-4在人类白喉毒素受体（HDTR）基因中引入了大量突变。通过白喉毒素（DT）筛选，研究人员成功获得了多个对DT不敏感的细胞克隆，并通过扩增子深度测序分析了这些克隆的基因型。结果显示，miniAGBE-4能够生成大量不同的碱基编辑突变，为研究HDTR基因的功能提供了丰富的突变资源。

主要结果

1. AGBE系统的构建与优化
   研究人员成功构建了多个版本的AGBE系统，并通过实验验证了其编辑效率。特别是miniAGBE-4，由于其较小的体积和高效的编辑能力，被选为后续实验的主要工具。

2. AGBE在人类细胞中的编辑效率
   在HEK293细胞中，AGBE系统能够同时实现A-to-G和C-to-G/T/A的碱基转换，且编辑效率与ABE相当。此外，AGBE系统还显著增加了插入/缺失突变的频率，为饱和突变筛选提供了更多样化的编辑结果。

3. AGBE在猪胚胎和原代细胞中的应用
   miniAGBE-4在猪胚胎和原代成纤维细胞中表现出高效的碱基编辑能力，且未显著影响胚胎的发育。这一结果表明，AGBE系统可以用于生成携带特定基因突变的动物模型。

4. AGBE的脱靶效应分析
   全基因组测序和RNA测序结果显示，miniAGBE-4在DNA和RNA水平上均未显著增加脱靶编辑的频率，表明其具有较高的安全性。

5. AGBE在人类细胞中的应用
   通过miniAGBE-4在HDTR基因中引入大量突变，研究人员成功获得了多个对DT不敏感的细胞克隆。这一结果表明，AGBE系统可以用于研究特定基因的功能及其突变对表型的影响。

结论

本研究开发了一种新型的双脱氨酶介导的碱基编辑系统AGBE，能够同时实现四种类型的碱基转换以及插入/缺失突变。AGBE系统在人类细胞、猪胚胎和原代细胞中均表现出高效的编辑能力，且具有较低的脱靶效应。这一系统为研究基因功能及其突变对表型的影响提供了强大的工具，具有广泛的应用前景。

研究亮点

1. 多重碱基编辑能力：AGBE系统能够同时实现A-to-G和C-to-G/T/A的碱基转换，显著增加了碱基编辑的多样性。
2. 高效插入/缺失突变：AGBE系统在引入碱基转换的同时，还能够显著增加插入/缺失突变的频率，为饱和突变筛选提供了更多样化的编辑结果。
3. 广泛应用前景：AGBE系统在人类细胞、猪胚胎和原代细胞中均表现出高效的编辑能力，表明其可以用于生成携带特定基因突变的动物模型，并用于研究基因功能及其突变对表型的影响。

其他有价值的内容

本研究还展示了AGBE系统在药物靶点基因突变筛选中的应用，为精准医学研究提供了新的工具。此外，研究人员还通过全基因组测序和RNA测序验证了AGBE系统的安全性，表明其在未来的临床应用中也具有潜力。