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作者及研究机构

本研究的主要作者包括Irmgard Hofmann、Yingxia Wen、Claudio Ciferri等，他们分别来自Novartis Pharma（瑞士巴塞尔）和Novartis Vaccines（美国马萨诸塞州剑桥）。该研究发表于2015年的《Biotechnology and Bioengineering》期刊。

学术背景

人类巨细胞病毒（Human Cytomegalovirus, HCMV）是全球范围内引起严重疾病的病原体，尤其在免疫系统受损的移植受体和新生儿中。尽管过去20年已测试了多种HCMV疫苗，但尚未有获批的疫苗能够有效预防HCMV疾病。HCMV的gh/gl/ul128/ul130/ul131a五聚体复合物（pentamer）是中和抗体的主要靶点，能够在小动物和非人灵长类中引发高滴度的中和抗体，因此被认为是开发有效HCMV疫苗的潜在候选物。然而，五聚体的生产需要高产量、功能稳定且符合商业生产规模的表达系统。本研究旨在开发一种哺乳动物表达系统，用于大规模生产功能性的HCMV五聚体。

研究流程

研究分为多个步骤，包括表达系统设计、细胞系选择、稳定细胞池的生成、单细胞分选、克隆筛选及大规模生产验证。

1. 表达系统设计
   研究团队评估了三种不同的表达策略：

   • 策略1：使用双载体系统，分别表达gh/gl和ul128/ul130/ul131a，并在基因间插入EV71内部核糖体进入位点（IRES）。
     
   • 策略2：同样使用双载体系统，但gh和gl分别由独立的HCMV启动子驱动。
     
   • 策略3：使用单载体系统，将所有五个基因整合到一个载体中，并插入EV71 IRES。
     

2. 细胞系选择
   研究评估了三种CHO细胞系（CHO-K1A、CHO-K1B和CHO-DUXB11）以确定最适合五聚体表达的细胞系。

3. 稳定细胞池的生成
   通过电穿孔法将表达载体转染到CHO细胞中，并利用抗生素和甲氨蝶呤（MTX）进行筛选。生成多个稳定细胞池，并通过ELISA检测五聚体表达水平。

4. 单细胞分选
   使用荧光激活细胞分选（FACS）技术，筛选出高表达五聚体的单细胞克隆。

5. 克隆筛选及大规模生产验证
   选择高表达克隆进行扩增，并在实验室规模的批次培养和50升生物反应器中验证五聚体表达水平。通过SDS-PAGE和尺寸排阻色谱（SEC）分析五聚体的纯度和结构完整性。

主要结果

1. 表达系统优化
   策略1和策略3在CHO-K1A细胞系中表现出较高的五聚体表达水平（30-70 mg/L），而策略2的表达水平显著较低（ mg/L）。CHO-K1A细胞系被确定为最适合五聚体表达的细胞系。

2. 单细胞克隆筛选
   通过FACS筛选，获得了一个高表达克隆，其在实验室规模的批次培养中五聚体表达水平达到137 mg/L，在50升生物反应器中达到370 mg/L。

3. 五聚体功能验证
   通过ELISA和SDS-PAGE分析，证实CHO表达的五聚体能够结合多种中和抗体，并在小鼠中引发高效的中和抗体反应。

结论

本研究成功开发了一种CHO细胞表达系统，能够大规模生产功能性的HCMV五聚体，为未来HCMV亚单位疫苗的开发提供了重要基础。五聚体的高表达水平和功能稳定性表明，该系统具有商业生产的潜力。

研究亮点

1. 高表达水平：通过优化表达策略和细胞系选择，五聚体表达水平达到370 mg/L，远高于以往报道的水平。
   
2. 功能验证：CHO表达的五聚体能够结合中和抗体并在小鼠中引发高效的中和反应，证实其作为疫苗候选物的潜力。
   
3. 创新性表达策略：研究团队首次在CHO细胞中成功表达了复杂的五聚体复合物，并通过单细胞分选技术显著提高了表达水平。

其他有价值的内容

研究还发现，五聚体的表达水平与mRNA水平不完全相关，提示翻译后修饰和蛋白质折叠可能是影响表达的关键因素。此外，研究团队开发的表达策略和筛选方法为其他复杂蛋白质复合物的生产提供了参考。