病毒对选择性自噬的干扰对病毒复制器官生成的关键作用

作者与发表信息

本文的主要作者为Yun Lan、Sophiewilhelmina van Leur、Julia Ayano Fernando、Ho Himwong、Martin Kampmann、Lewis Siu、Jingshu Zhang、Mingyuan Li、John M. Nicholls和Sumana Sanyal，通力合作完成。这项研究于2023年在《Nature Communications》期刊上发表，编号为14:2698，研究起始时间为2022年9月30日，并于2023年4月25日接受。

研究学术背景

本项研究聚焦于RNA病毒，如Flavivirus和冠状病毒，它们在人类细胞内通过利用细胞膜形成病毒复制隔室以进行自身复制。这些病毒会扩展内质网（ER）并重塑细胞膜，为其后代病毒组装和分泌提供场所。本研究的背景知识包括在前期的研究中发现病毒感染引发的脂滴自噬（Lipophagy）在黄病毒的组装过程中起到关键作用，而古老的泛素蛋白1（AUP1）和泛素结合酶UBE2G2在这一过程中扮演了重要角色。这一研究的目的是进一步探究UBE2G2在病毒复制器官生成过程中的具体作用及其机制。

研究流程

研究主要通过以下流程展开： 1. 细胞系构建： - 使用CRISPR/Cas9基因编辑技术生成UBE2G2缺陷细胞系HeLa，并检测UBE2G2蛋白表达情况。 - 通过定点突变技术生成失活的UBE2G2突变体，重新构建入野生型缺陷细胞中。

1. 病毒感染实验：

   • 使用Zika病毒（ZIKV）和登革热病毒（DENV）感染野生型及UBE2G2缺陷细胞，检测病毒产量。
   • 病毒感染后，使用流式细胞术和荧光显微镜检测病毒进入过程，同时使用荧光探针标记技术追踪病毒的融合过程。

2. 细胞溶解和蛋白质组分析：

   • 提取细胞溶解液，进行蛋白检测及双层膜结构分析。
   • 使用免疫沉淀和蛋白质印迹方法检测UBE2G2与AUP1的相互作用及特定蛋白质的翻译。

3. 病毒生产和复制器官成像：

   • 通过脉冲跟踪实验和电子显微镜（TEM）分析病毒复制器官的生成及其影响因素。
   • 使用荧光报告基质的Zika病毒复制子测定病毒RNA复制，并通过荧光显微镜可视化分析。

4. 脂滴和自噬评估：

   • 使用荧光染料和流式细胞术评估脂滴在病毒感染细胞中的数量和分布。
   • 通过LC3荧光标记研究UBE2G2对脂滴自噬及细胞自噬流通的影响。

5. 蛋白质降解及适应性应激分析：

   • 检测内质网应激反应和特异蛋白质（如HERPUD1、SEL1L、SEC62）的表达水平与降解。

主要研究结果

1. UBE2G2在病毒生成中的作用：

   • 发现UBE2G2缺陷细胞表现出显著的病毒产量下降，而恢复UBE2G2的野生型表现则可以恢复病毒产量，表明UBE2G2的酶活性对病毒生成至关重要。

2. 对病毒感染和复制的影响：

   • UBE2G2缺陷细胞在病毒进入环节并未表现出显著差异，但在病毒复制和感染过程中，病毒RNA复制量及蛋白质表达显著降低，病毒复制器官的形成受到显著抑制，导致病毒复制显著受阻。

3. 选择性自噬和脂滴周转：

   • UBE2G2不仅通过AUP1触发脂滴自噬，还通过降解内质网随球蛋白抑制内质网自噬以支持膜重塑。这一机制被证实为关键步骤阻止内质网的异常重塑与降解，最终导致病毒复制器官的生成并驱动病毒复制。

研究结论与意义

本研究揭示了UBE2G2在RNA病毒感染过程中通过选择性自噬和内质网重塑来生成病毒复制器官的关键角色。这一机制的破坏可能成为未来开发抗病毒疗法的新靶点。研究发现：UBE2G2通过参与脂滴自噬与内质网蛋白质降解过程，调控内质网重塑和病毒复制器官生成，对病毒复制起到关键作用。

研究亮点与新发现

• 选择性自噬的精细调控：UBE2G2通过与AUP1协作触发脂滴自噬，对于病毒复制的影响显著。
• 酶活性的核心作用：UBE2G2的酶活性在病毒复制器官形成及病毒生成过程中不可或缺。
• 内质网蛋白质降解机制：发现UBE2G2对内质网自噬和适应性应激蛋白质降解的双重调控机制，有助于深入理解病毒在宿主体内的增殖机制。

附加内容

研究中揭示的UBE2G2影响病毒自噬和复制的机制，扩展了对RNA病毒与宿主细胞间相互作用的理解，为制定新的抗病毒策略提供了宝贵的信息和潜在的药物靶点。未来可以进一步研究UBE2G2抑制剂在抗病毒治疗中的应用。