本文介绍了一项关于嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）T细胞治疗中启动子选择的研究。该研究由新西兰奥塔哥大学微生物与免疫学系的Ali Hosseini Rad S. M.、Aarati Poudel、Grace Min Yi Tan和Alexander D. McLellan共同完成，并于2020年7月24日发表在《PLOS ONE》期刊上。研究的主要目的是探讨不同启动子在CAR T细胞中驱动长链RNA表达的能力，特别是当RNA包含多个基因时，启动子的选择如何影响CAR T细胞的功能。
CAR T细胞疗法是一种有效的B细胞恶性肿瘤治疗方法，并逐渐显示出对其他血液系统癌症和实体瘤的治疗潜力。CAR T细胞的功能受到CAR多肽在T细胞表面表达水平的影响，而这一表达水平又受到启动子强度的调控。启动子不仅影响CAR的表达，还可以驱动其他基因的表达，以增强CAR T细胞的功能。然而，启动子在转录长链RNA或与慢病毒生产、转导效率的兼容性方面可能存在差异。因此，选择合适的启动子对于CAR T细胞的基因治疗至关重要。
研究团队选择了四种常用的强启动子（CMV、EF-1、HPGK和RPBSA），并比较了它们在驱动包含绿色荧光蛋白（GFP）、CAR和细胞生存基因MCL-1的长链RNA表达中的表现。研究的主要流程包括以下几个步骤：
质粒构建：研究人员构建了包含不同启动子的慢病毒载体，并在载体中插入了GFP、抗HER2 CAR和MCL-1基因的串联序列。这些基因通过P2A肽链连接，确保它们能够从同一个RNA转录本中表达。
细胞培养与慢病毒生产：使用HEK293T细胞进行慢病毒的生产，并通过流式细胞术检测病毒滴度。随后，研究人员从健康供体中分离出外周血单核细胞（PBMC），并从中分离出CD4和CD8 T细胞，进行慢病毒转导。
RNA提取与RT-PCR：在转导后48小时，提取细胞总RNA并进行逆转录PCR（RT-PCR），以检测不同启动子驱动的长链RNA表达水平。
蛋白质表达与功能分析：通过Western blot检测GFP、CAR和MCL-1的蛋白质表达水平，并通过流式细胞术分析CAR T细胞的激活、细胞因子释放和细胞毒性。
线粒体膜电位测定：为了评估MCL-1对CAR T细胞的保护作用，研究人员使用TMRE染色法检测了线粒体膜电位的变化。
研究结果显示，四种启动子在慢病毒滴度和转导效率方面没有显著差异，但在驱动长链RNA表达方面存在明显差异。EF-1启动子在驱动GFP、CAR和MCL-1的表达方面表现最佳，尤其是在原代T细胞中。CMV启动子在HEK293T细胞中表现出较高的蛋白质表达水平，但在原代T细胞中的表现较弱。HPGK和RPBSA启动子在驱动长链RNA表达方面表现较差。
在功能实验中，EF-1驱动的CAR T细胞表现出最强的细胞因子释放（IL-2和IFN-γ）和细胞毒性，而RPBSA驱动的CAR T细胞几乎无法检测到细胞因子的释放。此外，EF-1驱动的CAR T细胞在抵抗CD95L诱导的细胞死亡方面表现最佳，表明MCL-1的表达能够有效保护CAR T细胞免受激活诱导的细胞死亡（AICD）。
研究表明，启动子的选择对CAR T细胞的功能具有重要影响，尤其是在驱动长链RNA表达时。EF-1启动子在驱动长链RNA和短链RNA表达方面均表现出色，是CAR T细胞基因治疗中的最佳选择。此外，MCL-1作为抗凋亡基因，能够有效增强CAR T细胞的生存能力，尤其是在EF-1启动子的驱动下。
该研究为CAR T细胞治疗中的基因表达调控提供了新的见解，特别是在启动子选择和抗凋亡基因的应用方面。研究结果表明，EF-1启动子是驱动长链RNA表达的最佳选择，能够有效增强CAR T细胞的功能和生存能力。这一发现不仅具有重要的科学价值，还为CAR T细胞治疗的临床应用提供了新的策略。
研究还通过生物信息学分析比较了四种启动子的核心启动子元件和转录因子结合位点，发现EF-1启动子富含T细胞特异性转录因子的结合位点，这可能是其在T细胞中表现出色的原因之一。此外，研究还探讨了启动子长度对转录效率的影响，发现较长的启动子（如EF-1）可能具有更多的转录因子结合位点，从而增强其转录活性。
这项研究为CAR T细胞治疗中的基因表达调控提供了重要的实验依据，并为未来的基因治疗研究提供了新的方向。