这篇文档属于类型a，即报告了一项原创性研究。以下是针对该研究的学术报告：
本研究的主要作者包括Anton Kan、Ilia Gelfat、Sivaram Emani、Pichet Praveschotinunt和Neel S. Joshi。研究由哈佛大学Wyss生物启发工程研究所和约翰·保尔森工程与应用科学学院等多个机构合作完成。该研究于2021年发表在《ACS Synthetic Biology》期刊上。
本研究的主要科学领域是合成生物学（Synthetic Biology）和益生菌工程（Probiotic Engineering）。研究的背景是，益生菌Escherichia coli Nissle 1917（EcN）被广泛用于治疗某些胃肠道疾病，并逐渐成为开发治疗性工程菌的重要目标。然而，传统的质粒载体通常需要抗生素来维持，这在体内实验或治疗中往往不兼容。EcN天然含有两个质粒pMut1和pMut2，虽然它们的功能未知，但在细菌中非常稳定。因此，研究团队旨在将pMut质粒开发为一个稳定的平台，用于在体内实验中工程化EcN，并利用CRISPR-Cas9系统去除天然质粒。
研究包括以下几个主要步骤：
pMut质粒的工程化：研究团队系统地工程化了pMut1和pMut2质粒，使其包含选择标记、荧光标记、温度敏感表达系统和卷曲蛋白（Curli）分泌系统。这些系统可以将定制化的功能材料分泌到细胞外空间。研究团队还开发了一种CRISPR-Cas9系统，用于去除EcN中的天然质粒。
质粒的体内测试：研究团队在小鼠胃肠道中测试了工程化质粒的稳定性，发现工程化细菌在没有选择压力的情况下仍然能够维持质粒，并且分泌系统保持功能，将功能化的卷曲蛋白分泌到肠道中。
温度敏感表达系统的开发：研究团队开发了一个温度敏感的表达系统，基于tlpA36蛋白和ptlpA启动子。该系统在低于36°C时抑制基因表达，在高于36°C时允许基因表达。研究团队还通过突变ptlpA启动子，生成了一个具有不同表达强度的启动子库。
卷曲蛋白分泌系统的优化：研究团队使用合成的csgBACEFG操纵子表达卷曲蛋白，并通过融合E-tag和GFP纳米抗体（nanobody）来检测卷曲蛋白的分泌。研究团队还通过Congo Red荧光方法和过滤ELISA方法检测了卷曲蛋白的产量。
体内实验：研究团队在小鼠肠道中测试了工程化pMut质粒的保留率和蛋白质表达。实验结果表明，工程化质粒在小鼠胃肠道中能够稳定保留，并且能够表达和分泌卷曲蛋白。
pMut质粒的工程化：研究团队成功地将pMut1和pMut2质粒工程化为包含选择标记、荧光标记、温度敏感表达系统和卷曲蛋白分泌系统的载体。CRISPR-Cas9系统能够有效去除EcN中的天然质粒。
质粒的体内测试：工程化质粒在小鼠胃肠道中能够稳定保留，并且分泌系统保持功能，将功能化的卷曲蛋白分泌到肠道中。
温度敏感表达系统：研究团队开发了一个温度敏感的表达系统，并生成了一个具有不同表达强度的启动子库。该系统在37°C时能够高效表达基因，在30°C时表达显著降低。
卷曲蛋白分泌系统：研究团队通过合成的csgBACEFG操纵子成功表达了卷曲蛋白，并通过Congo Red荧光方法和过滤ELISA方法检测了卷曲蛋白的产量。融合GFP纳米抗体的卷曲蛋白能够从溶液中去除GFP。
体内实验：工程化pMut质粒在小鼠肠道中能够稳定保留，并且能够表达和分泌卷曲蛋白。纳米抗体融合的卷曲蛋白在肠道中表现出更高的信号。
本研究成功地将pMut质粒开发为一个稳定的平台，用于工程化EcN并在体内实验中应用。该平台简化了体内实验，避免了抗生素的使用，并且能够通过温度敏感的表达系统控制基因表达。研究结果表明，工程化pMut质粒在小鼠胃肠道中能够稳定保留，并且能够表达和分泌功能化的卷曲蛋白。这一平台为开发治疗性EcN细菌提供了快速开发的工具，并有助于研究肠道微生物组和开发治疗性工程菌。
重要发现：工程化pMut质粒在小鼠胃肠道中能够稳定保留，并且能够表达和分泌功能化的卷曲蛋白。
方法创新：研究团队开发了一个温度敏感的表达系统，并生成了一个具有不同表达强度的启动子库。此外，CRISPR-Cas9系统能够有效去除EcN中的天然质粒。
研究对象的特殊性：本研究以益生菌EcN为研究对象，开发了一个稳定的质粒平台，用于体内实验和治疗性工程菌的开发。
研究团队还开发了一种基于Congo Red荧光和过滤ELISA的方法，用于检测卷曲蛋白的产量。这一方法为研究卷曲蛋白的分泌提供了有效的工具。此外，研究团队还通过融合GFP纳米抗体，展示了卷曲蛋白的功能化应用。