该文档属于类型a，即单篇原创研究的报告。以下是针对该研究的学术报告：
研究作者及机构
本研究由Shaochuan Liu、Yuan Meng、Liang Liu、Yingge Lv、Feng Wei、Wenwen Yu、Limei Wang、Xiying Zhang、Xiubao Ren和Qian Sun等作者共同完成。研究团队来自天津医科大学肿瘤医院、国家癌症临床研究中心、天津市癌症预防与治疗重点实验室等多个机构。该研究于2022年发表在《Cancer Gene Therapy》期刊上。
学术背景
本研究的主要科学领域为肿瘤免疫治疗，特别是细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-Induced Killer, CIK）疗法在非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC）中的应用。CIK疗法是一种重要的过继性免疫治疗方法，主要由CD3+CD56+ T细胞组成，具有非MHC限制性的肿瘤杀伤能力。尽管CIK疗法在多种肿瘤中表现出良好的疗效，但在实体瘤治疗中的效果有限。因此，研究者尝试通过联合化疗药物（如培美曲塞）和免疫检查点抑制剂（如抗PD-1单克隆抗体）来增强CIK疗法的抗肿瘤效果。本研究的目的是探索培美曲塞、CIK疗法和抗PD-1单克隆抗体联合治疗的最佳给药顺序，以最大化治疗效果，并为临床实践提供实验依据。
研究流程
本研究分为多个步骤，主要包括细胞培养、动物实验、流式细胞术、免疫组化、Western blot分析、实时定量PCR（qPCR）和体外细胞毒性实验等。以下是各步骤的详细描述：
细胞培养
研究使用人肺腺癌细胞系（A549和H1299）和CIK细胞。CIK细胞通过外周血单个核细胞（PBMCs）扩增14天获得。细胞培养在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的1640培养基中进行。
动物实验
研究使用5周龄的NSG（NOD/SCID–IL-2Rγc null）小鼠，皮下注射A549细胞建立肿瘤模型。小鼠随机分为多个治疗组，分别接受培美曲塞、CIK细胞和抗PD-1单克隆抗体的不同给药顺序。肿瘤体积每周测量三次，计算肿瘤生长倍数（FCTG）。
流式细胞术
从小鼠外周血和肿瘤组织中分离单细胞悬液，使用流式细胞术检测CD3+、CD4+、CD8+、CD56+ T细胞和调节性T细胞（Treg）的比例。通过流式细胞术评估PD-1受体的占有率。
免疫组化
肿瘤组织制备成4微米石蜡切片，使用PD-L1抗体进行免疫组化染色，评估PD-L1的表达水平。
Western blot分析
从共培养系统中收集CIK细胞，提取蛋白质样本，使用AKT、p-AKT、ERK、p-ERK和GAPDH抗体进行Western blot分析，评估信号通路的激活状态。
实时定量PCR（qPCR）
从CIK细胞中提取总RNA，逆转录为cDNA，使用特异性引物进行qPCR，检测TBX21、EOMES和BATF等基因的表达水平。
体外细胞毒性实验
CIK细胞与A549和H1299细胞共培养6小时，检测乳酸脱氢酶（LDH）的释放，评估CIK细胞的杀伤能力。
主要结果
1. 培美曲塞与CIK疗法的给药顺序
研究发现，培美曲塞在CIK细胞注射前3天给药（P0 + C3组）能够最大化CIK疗法的抗肿瘤效果，而CIK细胞注射后3天给药（P3 + C0组）效果最差。P0 + C3组的肿瘤体积得到有效控制，且CD3+ T细胞和CD3+CD56+ T细胞在肿瘤组织中的浸润显著增加。
抗PD-1单克隆抗体的给药顺序
抗PD-1单克隆抗体在CIK细胞注射前给药（P0 + PD2 + C3组）能够显著提高PD-1受体的占有率，并增强CIK细胞的抗肿瘤功能。而在CIK细胞注射后给药（P0 + C3 + PD4组）则效果较差。
信号通路分析
Western blot和qPCR结果显示，抗PD-1单克隆抗体通过激活AKT和ERK信号通路，上调TBX21、EOMES和BATF等基因的表达，从而增强CIK细胞的杀伤能力。
PD-L1表达
免疫组化结果显示，培美曲塞诱导肿瘤组织中PD-L1的表达增加，这为抗PD-1单克隆抗体的作用提供了基础。
结论
本研究通过系统性的实验设计，确定了培美曲塞、CIK疗法和抗PD-1单克隆抗体联合治疗的最佳给药顺序，即培美曲塞在CIK细胞注射前3天给药，抗PD-1单克隆抗体在CIK细胞注射前1天给药。这一给药顺序能够最大化CIK疗法的抗肿瘤效果，为NSCLC患者提供了一种新的治疗选择。本研究的科学价值在于揭示了联合治疗中给药顺序的重要性，并为临床实践提供了实验依据。
研究亮点
1. 重要发现：首次系统性地研究了培美曲塞、CIK疗法和抗PD-1单克隆抗体联合治疗的给药顺序，明确了最佳治疗方案。 2. 方法创新：通过流式细胞术、Western blot和qPCR等多种实验技术，全面评估了CIK细胞的功能和信号通路激活状态。 3. 临床意义：为NSCLC患者的联合治疗提供了新的思路，具有重要的临床应用价值。
其他有价值的内容
本研究还探讨了抗PD-1单克隆抗体在体内环境中对CIK细胞功能的调控机制，发现CIK细胞在体内的修饰会影响PD-1受体的占有率。这一发现为进一步研究CIK细胞在体内的功能调控提供了新的方向。
以上是本研究的详细报告，旨在为其他研究者提供全面的研究背景、方法、结果和结论。