学术报告：关于《Calycosin extracted from Astragali Radix reduces NETs formation to improve renal fibrosis via TLR4/NF-κB pathway》的研究

主要作者和研究发表信息

本文的主要作者为Wenjie Cao、Linsheng Huang、Huifan Yu、Yongshuai Qian、Li Liu、Mao Xu、Siyi Li、Hong Zhou、Fei Li，他们分别来自湖北医药学院、太和医院、北京大学基础医学院等机构。文章刊登于《Journal of Ethnopharmacology》期刊，文章的DOI为10.1016/j.jep.2025.119391，记录显示文章于2024年8月16日收到，2025年1月20日正式接受。

研究的学术背景及动机

研究领域
本文属于中药药理学和免疫学领域，特别关注肾纤维化的发病机制及治疗。

研究背景
慢性肾病（Chronic Kidney Disease, CKD）具有较高的全球患病率，据统计2017年全球患病人数约达6.975亿。肾纤维化是CKD的核心病理机制，其特点为细胞外基质过度沉积、炎症反应及成纤维细胞持续激活，最终导致肾功能的不可逆衰退直至终末期肾病。目前针对CKD的临床治疗主要集中在病因控制，但并未直接针对间质性肾纤维化展开有效干预。

近年来，研究发现中性粒细胞胞外陷阱（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）在肾纤维化形成中具有重要作用。NETs由解聚的染色质DNA形成，嵌入了活性蛋白（如髓过氧化物酶MPO和瓜氨酸组蛋白H3 [Citrullinated Histone H3, CitH3]），过度形成NETs会损害肾小球和导致肾纤维化。

研究目的
尽管传统中药黄芪（Astragali Radix）及其主要活性成分黄芪素（Calycosin）已显示出抗炎、抗氧化和抗纤维化活性，其在抗肾纤维化中的机制尚不明确。本文旨在探讨黄芪素对肾纤维化的保护作用及其分子机制，重点关注黄芪素是否通过调节TLR4（Toll-like receptor 4）/NF-κB通路及抑制NETs形成而发挥功能。

研究方法与实验流程

整体实验设计
研究分为体内（小鼠）和体外（细胞）两个主要部分，分别采用单侧输尿管梗阻（Unilateral Ureteral Obstruction, UUO）模型小鼠及转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的NRK-52E细胞纤维化作为研究模型。

体内实验：小鼠模型
1. 实验对象
- 使用C57BL/6J小鼠，共48只，分6组：Sham（假手术）、Sham+黄芪素（60 mg/kg）、UUO模型、UUO+黄芪素（7、20、60 mg/kg）。

1. 实验模型

   • UUO模型通过结扎左侧输尿管建立，观察14天。

2. 干预措施

   • 实验组小鼠经灌胃给予不同剂量黄芪素。

3. 检测指标

   • 通过血清指标（血尿素氮和肌酐）的生化检测评估肾功能；
     
   • 组织学方法（HE染色、Masson染色和TUNEL荧光染色）观察组织病理学变化；
     
   • 蛋白水平检测（如α-SMA、FN、MMPs等）通过免疫印迹法（Western blot）。
     

体外实验：细胞实验
1. 实验对象
- 使用NRK-52E肾小管上皮细胞。

1. 实验设计

   • 以TGF-β1诱导细胞产生纤维化模型，同时联合黄芪素处理，检测纤维化标志物（如α-SMA、FN）的表达变化。

2. NETs形成研究

   • 通过使用PMA（Phorbol 12-myristate 13-acetate）刺激体外分离的人中性粒细胞诱导NETs形成，采用DNA荧光染色（Sytox Green）及扫描电镜观察NETs形态变化；进一步研究NETs对NRK-52E细胞纤维化过程的影响。

3. 通路分析

   • 联合使用TLR4抑制剂（TAK-242）分析黄芪素对TLR4/NF-κB信号通路的影响。

研究结果

1. UUO模型结果
   黄芪素显著改善UUO模型小鼠的病理指标，包括：

   • 减少梗阻肾脏重量增加及血清肌酐、尿素氮水平；
     
   • 显著降低肾组织中的炎症浸润、胶原沉积；
   • 抑制细胞凋亡相关蛋白（如Caspase-3）的活化。

2. 肾纤维化改善

   • 黄芪素减少了ECM积累及α-SMA、FN等纤维化标志物的表达；
   • 恢复了TGF-β1/Smad通路相关抑制分子Smad7的表达，阻止了过量的Smad2/3活化。

3. NETs形成抑制

   • 在体内和体外实验中，黄芪素显著降低了NETs相关蛋白（如MPO和CitH3）的表达，并减少NETs网络结构的生成。

4. TLR4/NF-κB信号通路干预

   • 黄芪素下调了TLR4及其下游关键分子（如p-NF-κB、p-IκBα）的表达，减少了炎症因子（如IL-6、IL-1β、TNF-α）的水平；

5. PMA诱导的NETs实验发现

   • NETs显著促进NRK-52E细胞的纤维化，但黄芪素处理能够有效抑制其纤维化促进作用。

结果的分析与结论

本文通过严格的实验流程验证了黄芪素对肾纤维化的保护作用，其机制主要表现为通过抑制NETs的生成及其对TLR4/NF-κB通路的调控，阻止了因细胞凋亡、炎症和纤维化导致的肾损伤进展。这一发现为黄芪素作为潜在抗肾纤维化药物的应用提供了科学依据。

研究的意义与亮点

1. 科学价值
   
   • 揭示了NETs在肾纤维化中的重要介导作用，扩展了人们对其在非感染性疾病中的认识。
2. 应用潜力
   
   • 提供了一种基于传统中药单体的新型治疗策略，为临床开发抗肾纤维化药物提供了理论支持。

总结与意义

本文是首次系统研究黄芪素通过TLR4/NF-κB通路干预NETs形成以缓解肾纤维化的机制性研究，为慢性肾病及其并发症的精准治疗提供了新方向。