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Sikai Ling, Shiqi Yang, Xinde Hu 等人来自上海交通大学、中国科学院神经科学研究所、复旦大学等机构，于2020年在《Nature Biomedical Engineering》上发表了这项研究。
该研究的主要科学领域是基因编辑和治疗性基因组编辑。CRISPR 是一种强大的基因组编辑工具，具有治愈遗传疾病、获得性疾病和传染病的潜力。然而，CRISPR 核酸酶和引导 RNA（gRNA）的有效靶向递送仍然是基因治疗应用中的关键瓶颈。本研究旨在开发一种有效且安全的基因编辑方法，通过使用改良的慢病毒载体来递送 Cas9 mRNA 和 gRNA，从而避免长期表达 Cas9 所带来的脱靶效应和抗 Cas9 免疫反应。
本研究包括多个实验步骤：
- 构建了一个高效的 mRNA 递送慢病毒系统：通过模仿 HIV-1 封装其 RNA 的机制，研究人员将 MS2 外壳蛋白（MS2C）融合到慢病毒 Gag-Pol 蛋白的 N 端或 C 端，并在目标 mRNA 上插入 MS2 干环（stem loop）。他们比较了不同修饰对 GFP mRNA 递送效率的影响，发现 N 端单体 MS2C 融合修饰的 Gag-Pol 最有效。
- 测试了 MLV-Cas9 的时间限制性核酸酶暴露基因组编辑能力：研究人员将 Cas9 插入 CMV 启动子和干环之间，然后在自失活的第三代慢病毒 3′ 长末端重复区（LTR）中插入 U6-gRNA 表达盒。通过逆转录过程，gRNA 序列被复制到 5′ LTR 中，每个病毒 episome 因此有两个 gRNA 表达盒副本。
- 开发了一种全合一的 MLV-CRISPR 系统：通过整合 MLV-Cas9 和 IDLV-gRNA 系统，研究人员生产了全合一的 CRISPR 慢病毒颗粒（MLV-CRISPR），并验证了其在不同细胞系中的基因编辑效率。他们还优化了 gRNA 骨架，显著提高了基因编辑效率。
- 在体内测试了 MLV-CRISPR 对视网膜色素上皮（RPE）细胞的特异性靶向能力：通过视网膜下注射，研究人员评估了 MLV-CRISPR 在小鼠模型中的生物分布和基因编辑效果。他们还进行了激光诱导的脉络膜新生血管（CNV）实验，以评估其治疗湿性年龄相关性黄斑变性（wAMD）的效果。
主要结果如下：
- 高效递送系统：N 端单体 MS2C 融合修饰的 Gag-Pol 显示出最高的 GFP mRNA 递送效率。与传统的慢病毒载体相比，MLP-GFP 在未饱和条件下表现出更高的转导效率。
- 时间限制性核酸酶暴露：MLV-Cas9 在体内仅在 VSV-G 存在的情况下诱导 indels，表明 Cas9 mRNA 传递依赖于 VSV-G 介导的内吞作用。与 Lenti-Cas9 相比，MLV-Cas9 的基因编辑效率在短期内略低，但在长时间内保持稳定。
- 全合一 MLV-CRISPR 提高基因编辑效率：全合一 MLV-CRISPR 系统在不同剂量下始终比分离系统更高效。与 Lenti-CRISPR 相比，MLV-CRISPR 在低剂量下仍表现出强大的基因编辑能力，且脱靶效应更低。
- 体内靶向 RPE 细胞：视网膜下注射后，MLV-CRISPR 几乎完全转导了单细胞 RPE 层，显示出高度的 RPE 特异性。qPCR 分析显示，注射眼的病毒基因组拷贝数显著高于未注射眼。
- 体内 VEGFA 基因敲除：单次注射 MLV-CRISPR 后，RPE 细胞中观察到 13% 的 indel 形成，且未检测到脱靶切割。VEGFA 水平显著下调，表明实际基因编辑在 RPE 细胞中应更高。
- 预防 CNV：在激光诱导的 wAMD 小鼠模型中，MLV-CRISPR 显著减少了 CNV 面积，降低了 63%，且未引发显著的先天性和适应性免疫反应。
结论表明，MLV-CRISPR 系统能够有效且特异性地靶向 RPE 细胞，通过瞬时核酸酶暴露使用 Cas9 mRNA 进行体内基因编辑，而不会引发显著的先天性和适应性免疫反应。这项研究为视网膜新生血管疾病的治疗提供了新的基础。
研究亮点包括： 1. 重要发现：MLV-CRISPR 系统在体内显著减少了 CNV 面积，降低了 63%，且未引发显著的先天性和适应性免疫反应。 2. 新颖方法：通过模仿 HIV-1 封装其 RNA 的机制，研究人员开发了一种高效的 mRNA 递送慢病毒系统。 3. 特殊研究对象：研究专注于视网膜色素上皮（RPE）细胞，这些细胞是成人眼睛后部唯一的 VEGFA 来源。
其他有价值的内容包括：MLV-CRISPR 系统可以扩展到递送编码其他类型 Cas9 核酸酶、碱基编辑器、主编辑器和表观基因组编辑器的 mRNA。此外，初步数据显示，慢病毒颗粒还可以递送 ABE-max，在两个不同位点的效率分别超过 31% 和 63%。