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本研究的主要作者包括Julia Engelhorn、Samantha J. Snodgrass、Amelie Kok等，来自多个研究机构，如德国杜塞尔多夫海因里希·海涅大学的分子生理学研究所、美国爱荷华州立大学的生态、进化与有机体生物学系等。该研究尚未经过同行评审，目前以预印本形式发布于biorxiv，发布日期为2024年4月20日，DOI为10.1101⁄2023.08.08.551183。
本研究属于植物遗传学和基因组学领域，旨在解析转录因子（Transcription Factor, TF）结合位点的遗传变异如何影响玉米表型遗传性。过去的研究表明，非编码变异在植物表型多样性中占据了约50%的加性遗传方差，但高效识别功能性非编码变异仍具有挑战性。转录因子结合位点的变异（cis-elements）在基因调控中起关键作用，然而在植物中缺乏高分辨率的功能变异图谱。因此，本研究的目标是通过构建玉米叶片的全基因组转录因子结合位点图谱（pan-cistrome），揭示这些变异如何解释玉米表型遗传性，并为复杂性状的多靶点工程提供支持。
本研究主要包括以下几个步骤：
实验设计与样本准备
研究使用了25个玉米杂交种的F1代，这些杂交种由高基因组质量的亲本与参考基因组B73杂交获得。样本包括在正常浇水和干旱条件下的玉米叶片，每个杂交种有三个生物学重复。
MOA-seq（MNase-defined cistrome occupancy analysis）实验
利用MOA-seq技术，研究团队对玉米叶片的细胞核进行了全基因组范围的转录因子结合位点分析。MOA-seq通过识别MNase酶切割的小片段DNA（通常小于100bp），能够高分辨率地检测转录因子结合位点。实验数据通过双参考基因组（B73与亲本基因组）进行比对，以减少参考基因组偏差。
数据质量控制与分析
通过比对MOA-seq和RNA-seq数据，研究团队量化了每个单倍型特异的转录因子结合位点，并识别了约210,000个与cis-element结合相关的遗传变异，称为结合数量性状位点（binding quantitative trait loci, bQTL）。数据分析包括单倍型特异的结合位点识别、DNA甲基化差异分析以及局部关联分析。
功能验证与候选基因分析
研究团队通过对比已知的功能性位点（如Vgt1、Trehalase1等），验证了bQTL的功能性。此外，还通过瞬时表达实验验证了候选基因（如Zmtiny）在干旱响应中的调控作用。
转录因子结合位点的遗传变异
研究团队在25个玉米杂交种中识别了约210,000个bQTL，这些bQTL解释了约70%的测试性状的遗传变异。bQTL与多个已知的功能性位点（如Vgt1、Trehalase1等）重合，表明其功能性。
单倍型特异的结合位点与基因表达的关系
研究发现，单倍型特异的转录因子结合位点与基因表达水平显著相关。例如，在Zmtiny基因的上游区域，干旱条件下MOA-seq信号与基因表达水平呈正相关。
DNA甲基化对转录因子结合的影响
研究显示，DNA甲基化（尤其是CG和CHG甲基化）显著影响转录因子结合位点的亲和性。大多数bQTL位点在高甲基化等位基因上表现出较低的MOA-seq信号。
干旱响应的cis-element调控
在干旱条件下，研究团队识别了约126,000个干旱响应的bQTL，这些位点与干旱相关基因（如Zmnac111、Zmso等）的表达变化密切相关。
本研究通过高分辨率的MOA-seq技术，构建了玉米叶片的全基因组转录因子结合位点图谱，揭示了bQTL在解释玉米表型遗传性中的重要作用。研究结果表明，转录因子结合位点的遗传变异是玉米复杂性状遗传变异的主要来源之一。此外，研究还发现了多个与干旱响应相关的候选基因，为未来的智能育种提供了潜在靶点。
高分辨率的转录因子结合位点图谱
本研究首次在玉米中构建了高分辨率的全基因组转录因子结合位点图谱，为解析植物基因调控网络提供了重要工具。
bQTL的发现与功能验证
研究识别了约210,000个bQTL，并通过多种方法验证了其功能性和与表型变异的关联。
干旱响应的cis-element调控机制
研究揭示了干旱条件下cis-element的动态变化，为理解植物对干旱的分子响应机制提供了新见解。
本研究还开发了基于双参考基因组的分析方法，有效解决了单参考基因组分析中的偏差问题。此外，研究团队公开了所有MOA-seq和RNA-seq数据，为后续研究提供了宝贵资源。
通过本研究，科学家们能够更深入地理解玉米复杂性状的遗传基础，并为作物改良提供了新的研究方向。