该研究由Sudha Shukal、Xiao Hui Lim、Congqiang Zhang和Xixian Chen共同完成，研究团队来自新加坡食品与生物技术创新研究所（Singapore Institute of Food and Biotechnology Innovation, SIFBI）和新加坡科技研究局（Agency for Science, Technology and Research, A*STAR）。该研究于2022年发表在期刊《Microbial Cell Factories》上，题为“Metabolic engineering of Escherichia coli BL21 strain using simplified CRISPR-Cas9 and asymmetric homology arms recombineering”。

学术背景

该研究属于代谢工程和合成生物学领域，主要关注利用CRISPR-Cas9技术对大肠杆菌BL21菌株进行基因组编辑，以提高其代谢产物的生产能力。CRISPR-Cas9系统作为一种高效的基因组编辑工具，已在多种生物中广泛应用，尤其是在微生物中用于基因敲除、插入和突变。然而，传统的CRISPR-Cas9技术在BL21菌株中的应用存在效率低、成本高、耗时长等问题，特别是同源臂（homology arms）的制备过程复杂且低效。因此，本研究旨在优化CRISPR-Cas9在BL21菌株中的应用，简化同源臂的设计和制备流程，并通过基因编辑提高BL21菌株的番茄红素（lycopene）产量。

研究流程

研究分为以下几个主要步骤：

1. CRISPR-Cas9基因敲除系统的优化
   研究团队首先在BL21菌株中优化了CRISPR-Cas9基因编辑系统，成功在一次编辑中删除了10 kb的DNA片段。为了进一步简化流程，研究团队开发了一种单步PCR制备不对称同源臂（asymmetric homology arms, AHA）的方法，与传统方法相比，显著缩短了时间并降低了成本。该方法的创新之处在于，仅需两条引物即可通过PCR生成不对称同源臂，无需复杂的克隆或重叠PCR步骤。

2. 基因敲除效率的验证
   为了验证优化后的工作流程的鲁棒性，研究团队在BL21基因组中成功删除了26/27个基因。特别值得注意的是，研究团队提出了一个通用的gRNA设计启发式方法，以提高CRISPR-Cas9系统的效率。通过针对16个基因进行迭代删除，研究团队最终删除了7个基因，使番茄红素产量提高了约三倍。

3. 不对称同源臂的优化
   研究团队进一步优化了不对称同源臂的设计，测试了四种不同的同源臂设计，并发现当上游同源臂长度为50 bp、下游同源臂长度为500 bp时，敲除效率最高。通过系统性地测试不同长度的上游同源臂，研究团队发现，当上游同源臂长度≥20 bp时，敲除效率保持不变。研究团队将这一方法命名为CRASH（CRISPR-Cas9 and asymmetric homology arm mediated genome modification）。

4. 多基因敲除的验证
   研究团队利用CRASH协议在BL21基因组中验证了27个基因的敲除效率，其中26个基因成功被删除，18个基因的敲除效率≥75%。研究团队还通过实验验证了gRNA设计的重要性，并提出了基于实验结果的gRNA设计启发式方法。

5. 番茄红素产量的提高
   研究团队通过迭代删除BL21基因组中的多个基因，并结合细胞大小调节、三酰甘油（triacylglycerol, TAG）代谢途径的优化和乙酰辅酶A（acetyl-CoA）通量的重定向，成功将番茄红素产量提高了约三倍。具体而言，研究团队删除了影响细胞大小的基因（如envc和zapb），并通过过表达TAG途径基因进一步提高了番茄红素的产量。

主要结果

1. CRISPR-Cas9系统的优化
   研究团队成功优化了CRISPR-Cas9系统，使其在BL21菌株中的基因敲除效率显著提高。通过使用不对称同源臂，研究团队在单次编辑中成功删除了10 kb的DNA片段，并验证了其在删除多个基因中的高效性。

2. 不对称同源臂的设计
   研究团队发现，当上游同源臂长度为50 bp、下游同源臂长度为500 bp时，敲除效率最高。通过系统性地测试不同长度的上游同源臂，研究团队确定了20 bp为上游同源臂的最小有效长度。

3. 多基因敲除的验证
   研究团队在BL21基因组中成功删除了26/27个基因，验证了CRASH协议的高效性。研究团队还通过实验验证了gRNA设计的重要性，并提出了基于实验结果的gRNA设计启发式方法。

4. 番茄红素产量的提高
   通过迭代删除BL21基因组中的多个基因，并结合细胞大小调节、TAG代谢途径的优化和乙酰辅酶A通量的重定向，研究团队成功将番茄红素产量提高了约三倍。

结论

该研究通过优化CRISPR-Cas9系统，提出了一种高效、低成本的不对称同源臂设计方法，显著提高了BL21菌株的基因编辑效率。研究团队通过迭代删除多个基因，并结合代谢途径的优化，成功将番茄红素产量提高了约三倍。该研究不仅为BL21菌株的代谢工程提供了新的工具和方法，还为其他大肠杆菌菌株的基因组编辑提供了参考。

研究亮点

1. 创新性的不对称同源臂设计
   研究团队开发了一种单步PCR制备不对称同源臂的方法，显著简化了同源臂的制备流程，降低了成本和时间消耗。

2. 高效的CRASH协议
   研究团队提出的CRASH协议在BL21菌株中表现出高效的基因敲除能力，成功删除了多个基因，验证了其鲁棒性。

3. 番茄红素产量的显著提高
   通过迭代删除多个基因并结合代谢途径的优化，研究团队成功将番茄红素产量提高了约三倍，展示了该技术在代谢工程中的应用潜力。

其他有价值的内容

研究团队还通过实验验证了gRNA设计的重要性，并提出了基于实验结果的gRNA设计启发式方法，为未来CRISPR-Cas9系统的应用提供了重要的参考。此外，研究团队还探讨了细胞大小调节和TAG代谢途径对番茄红素产量的影响，为代谢工程提供了新的思路。

该研究通过优化CRISPR-Cas9系统，提出了一种高效、低成本的基因编辑方法，显著提高了BL21菌株的番茄红素产量，为代谢工程和合成生物学领域提供了重要的工具和方法。