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作者与机构
本研究由Rongkun Tao、Kui Wang、Tian-lun Chen、Xin-xin Zhang、Jian-bin Cao、Wen-quan Zhao、Jiu-lin Du和Yu Mu共同完成。研究团队来自中国科学院神经科学研究所、中国科学院遗传与发育生物学研究所、中国科学院大学、上海科技大学以及温州医科大学附属台州医院麻醉科。研究于2023年发表在《Cell Discovery》期刊上。
学术背景
L-色氨酸（L-tryptophan）是脊椎动物中最稀有的必需氨基酸，对蛋白质合成至关重要。色氨酸代谢通过犬尿氨酸（kynurenine）和血清素（serotonin）途径在免疫反应和神经活动的代谢调控中扮演关键角色。色氨酸代谢的动态重编程与炎症密切相关，而炎症在神经疾病、心血管疾病、衰老和癌症中起重要作用。然而，现有的色氨酸浓度测量方法（如高效液相色谱法HPLC和荧光共振能量转移纳米传感器FLIPWs）存在耗时长、检测范围有限和光漂白效应等问题，难以在体内定量和系统性地测量色氨酸代谢。因此，本研究旨在开发一种新型的基因编码比率指示剂，用于在体内外定量检测色氨酸的动态变化。
研究流程
1. 传感器设计与筛选
研究团队将一种循环排列的超折叠YFP（circularly permuted superfolder YFP, cpYFP）插入细菌色氨酸阻遏蛋白（TrpR）的柔性环区域（位点64-69），该区域在色氨酸结合时会发生较大的构象变化。通过连接子截短和半理性设计，筛选出对色氨酸具有约6倍荧光响应的突变体，最终开发出名为GRIT（Genetically Encoded Ratiometric Indicator for Tryptophan）的传感器。此外，还构建了无响应的对照传感器GRITol。
传感器特性验证
GRIT传感器在420 nm和500 nm处有两个激发峰，在515 nm处有一个发射峰。色氨酸结合后，GRIT在485 nm和420 nm激发下的荧光分别增加了4倍和减少了3.3倍，比率荧光变化达到1300%，其表观解离常数（Kd）约为430 μM。GRIT对L-色氨酸具有高选择性和抗环境干扰能力（如pH变化）。
细胞实验
在HeLa细胞中表达GRIT传感器，通过共聚焦显微镜或微孔板读数器测量荧光。添加色氨酸后，细胞质GRIT的激发比率增加了2倍，而添加组氨酸（His）后信号减少了约74%。细胞质游离色氨酸水平估计为157.2 ± 17.4 μM，与HPLC/MS测量结果（207.3 ± 8.2 μM）相当。
氨基酸分类实验
研究将氨基酸分为三类：I类氨基酸（如His）诱导快速色氨酸输出动力学（约37 μM/min）；II类氨基酸（如Ala、Asn、Gln、Ser、Thr）诱导较慢的色氨酸输出（约6.8–14 μM/min）；III类氨基酸（如Arg、Asp、Glu、Gly、Lys、Pro）对色氨酸动态无显著影响。使用SLC7A5特异性拮抗剂（JPH203）可阻断I类和II类氨基酸诱导的色氨酸转运。
炎症实验
用10 ng/mL IFN-γ处理HeLa细胞，显著上调吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO1）表达，导致细胞质色氨酸池在48小时内减少。使用IDO1抑制剂Epacadostat可阻断这一过程。
斑马鱼实验
在斑马鱼幼虫中广泛表达GRIT传感器，通过荧光测量体内色氨酸动态。添加5 mM色氨酸后，单细胞和全身的GRIT激发比率在3小时内显著增加，而GRITol表达的动物无此现象。脑和肌肉中的游离色氨酸水平分别增加了140%和91%。添加20 mM His后，脑和肌肉中的色氨酸水平分别降至137.9 ± 13.8 μM和77.8 ± 7.9 μM。
炎症诱导实验
通过向斑马鱼卵黄注射脂多糖（LPS）诱导炎症反应，观察到色氨酸在不同组织中的系统性重新分布。脑、肌肉和脊髓中的色氨酸浓度分别增加了60%、26%和13%，而血浆色氨酸水平减少了近一半。
主要结果
1. 成功开发了GRIT传感器，具有高灵敏度、选择性和抗环境干扰能力，适用于长期记录和多种场景。 2. 在HeLa细胞中验证了GRIT传感器的性能，并量化了细胞内色氨酸的动态变化。 3. 通过氨基酸分类实验，揭示了SLC7A5在色氨酸转运中的关键作用。 4. 在斑马鱼模型中，GRIT传感器成功监测了体内色氨酸的动态变化，并揭示了炎症诱导的色氨酸重新分布。
结论与意义
本研究开发的GRIT传感器为色氨酸代谢的定量和系统性研究提供了强大工具，进一步揭示了色氨酸在生理和病理条件下的功能。研究不仅为理解色氨酸代谢的调控机制提供了新视角，还为炎症相关疾病的治疗策略开发提供了潜在靶点。此外，斑马鱼模型中的系统性色氨酸代谢描述为人类代谢研究提供了重要参考。
研究亮点
1. 开发了新型基因编码比率指示剂GRIT，具有高灵敏度、选择性和抗环境干扰能力。 2. 首次在斑马鱼模型中系统性描述了色氨酸的动态变化和炎症诱导的重新分布。 3. 揭示了SLC7A5在色氨酸转运中的关键作用，为炎症相关疾病的治疗提供了新思路。
其他有价值的内容
研究还比较了GRIT与现有色氨酸测量方法的优劣，证明了GRIT在动态范围、光漂白效应和长期记录方面的显著优势。这些发现为未来色氨酸代谢研究提供了重要工具和方法学支持。