本文由Salem S. Ghrebi、Gethin Rh. Owen和Donald M. Brunette共同撰写，他们均来自加拿大不列颠哥伦比亚大学牙科学院的口腔生物与医学科学系。该研究于2007年发表在《Microscopy Research and Technique》期刊上，题为“Triton X-100 Pretreatment of LR-White Thin Sections Improves Immunofluorescence Specificity and Intensity”。研究的主要目标是开发一种能够在组织切片中特异性识别招募型巨噬细胞的技术，并通过免疫荧光染色提高标记的强度和特异性。

研究背景

在医学设备植入后，机体会启动一系列反应，包括慢性炎症反应和伤口愈合过程。巨噬细胞在这一过程中扮演了重要角色，尤其是招募型巨噬细胞（recruited macrophages），它们通过分泌具有趋化、促有丝分裂和促血管生成特性的活性蛋白，促进伤口愈合。这些招募型巨噬细胞可以通过细胞质标记物ED1（一种位于溶酶体膜上的糖蛋白）来与常驻型巨噬细胞区分开来。然而，ED1的免疫染色在组织处理过程中常常面临抗原性丧失和抗体难以接近抗原的问题。因此，研究团队旨在开发一种能够保护抗原并提高免疫荧光标记强度的技术。

研究方法

研究分为几个主要步骤，首先在培养的巨噬细胞上优化染色程序，随后将这一方法应用于LR-White树脂包埋的巨噬细胞切片。具体步骤如下：

1. 培养巨噬细胞的免疫荧光标记：

   • 使用大鼠肺泡巨噬细胞NR8383进行培养，并在钛涂层玻璃盖玻片上培养24小时。
   • 细胞经过磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，分别进行固定和Triton X-100处理。Triton X-100是一种非离子表面活性剂，能够溶解脂质而不使蛋白质变性。
   • 固定后，细胞经过牛血清白蛋白（BSA）和正常山羊血清的封闭处理，随后与ED1单克隆抗体孵育，最后使用Alexa Fluor 546标记的二抗进行荧光标记。

2. LR-White树脂包埋巨噬细胞切片的处理：

   • 巨噬细胞经过离心后形成细胞团块，经过部分脱水后，使用LR-White树脂进行包埋。
   • 切片后，部分切片经过Triton X-100预处理，随后进行免疫荧光标记。

3. Triton X-100对LR-White切片的影响：

   • 通过荧光显微镜和扫描电子显微镜（SEM）观察Triton X-100处理对切片的影响，评估不同浓度和处理时间对ED1标记强度的影响。

研究结果

1. 培养巨噬细胞的免疫荧光标记：

   • 未经过Triton X-100处理的细胞显示出非特异性染色，而经过Triton X-100处理的细胞则表现出更高的ED1标记强度和特异性。
   • 最佳处理条件为0.2% Triton X-100处理2分钟。

2. LR-White树脂包埋切片的免疫荧光标记：

   • 经过Triton X-100预处理的切片显示出更高的ED1标记强度和特异性，而未处理的切片则标记较弱。
   • 延长Triton X-100处理时间或增加浓度会导致ED1标记强度下降，甚至细胞结构的破坏。

3. Triton X-100对LR-White切片的影响：

   • SEM观察显示，Triton X-100处理主要影响了组织区域的表面形貌，而树脂本身未受影响。
   • 通过对比不同处理条件，研究团队确定0.2% Triton X-100处理2分钟是最佳条件。

讨论与结论

研究结果表明，Triton X-100预处理能够显著提高LR-White树脂包埋切片中ED1抗原的免疫荧光标记强度和特异性。Triton X-100通过提取未固定的脂质成分，增加了抗体与抗原的接触机会，从而提高了标记效果。这一技术不仅适用于ED1抗原，还可能广泛应用于其他膜结合细胞内蛋白的免疫标记。

研究亮点

1. 创新性：首次报道了Triton X-100预处理LR-White树脂切片以提高免疫荧光标记强度的技术。
2. 应用价值：该技术为免疫荧光标记提供了一种新的优化方法，特别是在处理细胞内抗原时具有重要应用前景。
3. 科学价值：研究揭示了Triton X-100在免疫标记中的作用机制，为进一步优化免疫染色技术提供了理论依据。

总结

该研究通过优化Triton X-100预处理条件，成功提高了LR-White树脂包埋切片中ED1抗原的免疫荧光标记强度和特异性。这一技术不仅为免疫荧光标记提供了新的方法，还为研究细胞内抗原的定位和功能提供了重要工具。