这篇文档属于类型a，即报告了一项原创性研究。以下是对该研究的学术报告：
本研究的主要作者包括Loϊc Binan、Aiping Jiang、Serwah A. Danquah等，他们来自Broad Institute of MIT and Harvard、Boston University等多个研究机构。该研究于2025年4月17日发表在《Cell》期刊上。
本研究属于分子生物学和基因组学领域，旨在通过结合CRISPR筛选和空间转录组学技术，揭示细胞内、细胞间以及功能性转录调控网络。CRISPR-Cas9技术已经在基因功能研究中展现出强大的能力，尤其是在大规模筛选基因功能方面。然而，传统的CRISPR筛选方法通常无法在单细胞水平上同时获取基因表达和空间信息。为了解决这一问题，研究者开发了一种名为Perturb-FISH的新方法，结合了高通量成像、空间转录组学和原位引导RNA（guide RNA, gRNA）检测技术，能够在单细胞水平上分析分子和功能状态。
Perturb-FISH方法的开发
Perturb-FISH结合了多重错误鲁棒荧光原位杂交（multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization, MERFISH）和原位gRNA扩增技术。研究者通过改造lentiviral载体，在U6启动子和gRNA序列之间插入T7启动子，使得在固定细胞中可以通过T7聚合酶进行局部gRNA扩增。随后，通过蛋白质酶清除步骤和标准的MERFISH流程，对gRNA和mRNA进行染色和成像。
实验设计
研究者在THP1来源的巨噬细胞中进行了CRISPR筛选，使用74个gRNA靶向35个基因，并在脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激后分析基因表达变化。同时，研究者还在三维异种移植模型中分析了肿瘤-免疫细胞的相互作用，并在人类诱导多能干细胞（human-induced pluripotent stem cells, hiPSC）来源的星形胶质细胞中进行了自闭症谱系障碍（autism spectrum disorder, ASD）风险基因的功能筛选。
数据采集与分析
研究者通过Perturb-FISH方法获取了单细胞的基因表达和gRNA信息，并使用FR-Perturb算法推断基因敲除（knockout, KO）的效果。通过比较Perturb-FISH和Perturb-seq（基于单细胞RNA测序的CRISPR筛选）的结果，验证了Perturb-FISH的可靠性。
Perturb-FISH的验证
研究者在THP1巨噬细胞中验证了Perturb-FISH的可靠性，发现其与Perturb-seq的结果高度一致。例如，靶向MAP3K7、IRAK1、TRAF6和RELA的gRNA在两种方法中显示出相似的基因表达变化。
细胞密度对基因表达的影响
研究发现，某些基因的表达受到细胞密度的显著影响。例如，TNF和IL1A的表达在细胞密度较高时分别增加了1.34倍和减少了2.6倍。此外，NFKB1的敲除在低密度细胞中显著上调了TNF的表达，而在高密度细胞中则没有显著影响。
细胞间相互作用
研究者发现，某些基因敲除会影响邻近未敲除细胞的基因表达。例如，MYD88的敲除会导致邻近细胞中TNF和CD14的表达上调。
ASD风险基因的功能筛选
在hiPSC来源的星形胶质细胞中，研究者发现某些ASD风险基因的敲除会导致钙离子活动的异常。例如，USP9X的敲除与钙离子活动表型的变化相关，并影响了多个与钙离子结合和突触功能相关的基因表达。
Perturb-FISH方法能够在单细胞水平上同时获取基因表达和空间信息，揭示了细胞内、细胞间以及功能性转录调控网络。该方法不仅能够高效地分析基因敲除的效果，还能够揭示细胞密度和细胞间相互作用对基因表达的调控机制。此外，Perturb-FISH在ASD风险基因的功能筛选中也展现出强大的应用潜力，为理解ASD的分子机制提供了新的视角。
研究者还展示了Perturb-FISH在肿瘤异种移植模型中的应用，揭示了肿瘤细胞与免疫细胞之间的遗传相互作用，为肿瘤免疫治疗提供了新的研究思路。
通过这项研究，Perturb-FISH方法为功能基因组学研究提供了新的工具，特别是在单细胞水平上解析复杂的基因调控网络方面具有重要的科学和应用价值。