学术报告：核仁中47S前体rRNA的定向分选与浓密纤维成分（DFC）装配的机制研究

研究概况

这项研究由Run-Wen Yao、Guang Xu、Ying Wang等多个作者完成，主要隶属于中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所和中科院-马普计算生物学伙伴研究所等机构，通讯作者为Ling-Ling Chen。文章以标题《Nascent pre-rRNA sorting via phase separation drives the assembly of dense fibrillar components in the human nucleolus》发表于Molecular Cell期刊，发表时间为2019年12月5日。论文聚焦核仁这一细胞器的亚结构，尤其探讨核仁中初生47S前体rRNA的分选机制及相关蛋白在无膜细胞区域中的相分离行为。

学术背景

核仁与核糖体的生成密切相关，是哺乳动物细胞内负责rDNA（核糖体DNA）转录与前体rRNA (pre-rRNA) 加工的关键场所。核仁的超微结构由纤维中心（Fibrillar Centers，简称FC）、浓密纤维成分（Dense Fibrillar Component，简称DFC）以及颗粒成分（Granular Component，简称GC）构成。FC主要负责rDNA的活性转录，而DFC是pre-rRNA最初加工的场所。然而，关于如何实现核仁中新生rRNA的定向分选，已有的认识较为有限。FC/DFC这一亚区是研究nascent rRNA动态的重要区域，其超微结构中各蛋白质和核酸的相互作用为研究重点。

已知核仁细胞区域的装配不依赖于脂膜，而是由RNA结合蛋白（RNA Binding Protein，简称RBP）和RNA通过液-液相分离机制形成的高浓度区域。然而，具体的分子机制及如何利用RBP中无序区（Intrinsically Disordered Regions，简称IDR）调控RNA分选和相分离，目前仍缺乏详细研究。本研究旨在解析FC/DFC区域的超微结构及新生47S前体rRNA在DFC中的分选机制，并探讨这些过程与液-液相分离机制的关系。

研究流程

研究共包括以下主要步骤：

1. 核仁超微结构的可视化
研究采用了Structured Illumination Microscopy (SIM)等超分辨成像技术对活细胞中不同核仁亚区如FC、DFC、GC进行成像。通过对标记核仁结构蛋白RPA194、Fibrillarin（FBL）及B23的细胞系进行观察，研究显示FC/DFC超微结构嵌套在GC内。此外，SIM较高的分辨率揭示了FC区域Pol I转录复合物主要集中于FC/DFC边缘，而不同细胞类型中FC/DFC单元的数量和形态具有一定的特异性。
样品：使用HeLa、HEK293等多细胞系；标本包括固定细胞和活细胞。
关键结果：所有FC/DFC单元中共检测到2-3个活性rDNA复制单元。

2. 活跃和非活跃rDNA的组织模式
通过荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）研究rDNA在FC/DFC中的活性与分布。研究发现不仅活跃的NOR区域中存在非活跃的rDNA簇，FC/DFC单元每单元平均包含2.5份活跃的rDNA拷贝。

3. 前体rRNA加工因子（PF）的分布与组织
多种pre-rRNA加工因子（Processing Factors，简称PF），如NOP56、DKC1、NHP2L1等，与FBL一起形成DFC的簇状分布。通过3D建模，研究显示DFC中平均包含18-24个独立小簇，而簇间间隔约为180纳米。

4. 新生47S pre-rRNA从FC/DFC边界向DFC的迁移
通过单分子RNA FISH（smFISH）和高分辨成像技术，研究表明，47S前体rRNA的5’末端在Pol I转录时已经进入DFC，而其后续部分主要停留在FC/DFC边界。此外，研究通过小发夹RNA敲降多个染色体核糖体小亚基复合物（SSU Processome）组件，发现FBL对定向分选至关重要。

5. FBL IDR的关键角色
FBL通过N端富含甘氨酸和精氨酸的无序区（GAR）实现自我聚集，并进一步结合47S pre-rRNA促进DFC装配。通过体外实验与荧光能量共振转移（FRET）实验，研究验证了FBL的GAR区域决定了其液-液相分离能力，并揭示GAR长度与FBL自我聚集能力呈正相关。

6. 分选与DFC装配的关系
研究通过Cas13d系统干扰FBL与47S pre-rRNA结合，显示nascent RNA分选不足会显著影响DFC的形成与稳定性，强调了分选过程对核仁组织的重要性。

主要研究结果

1. FC/DFC超微结构：
   每个FC/DFC单元包含2-3个活跃rDNA拷贝，Pol I复合物集中在边界处，DFC中工业簇支持通过多阶段相分离方式组织形成。

2. 47S前体rRNA定向分选：
   研究首次证明FBL通过其N端IDR驱动47S pre-rRNA从边界迁移至DFC。丢失FBL或扰乱其与rRNA的结合，会阻碍DFC的最终形成。

3. FBL自我聚集机制：
   FBL的GAR区通过多价相互作用形成液-液相分离小液滴，同时促进RNP簇形成；分选效率受GAR长度调控。

4. 分选对DFC装配的作用：
   47S pre-rRNA分选是DFC液滴聚合及核仁大结构装配的先决条件。

研究结论与意义

本研究系统解析了核仁FC/DFC超微结构及47S前体rRNA的分选机制，表明通过FBL IDR介导的相分离可以驱动核仁区域的功能化。研究揭示了DFC装配的必要条件及FBL功能的核心特性，为理解细胞器中RNA的动态行为及其无膜结构的调控提供了新理论基础。这一发现可能在未来引导癌症、神经退行性疾病等领域的核仁功能异常机制研究。

研究亮点

• 首次明确FC/DFC单位的超微结构：揭示了活跃转录区域的精确分布。
• 揭示FBL的双重功能：同时参与pre-rRNA分选与DFC结构成型。
• 液-液相分离调控初生RNA转运新机制：验证GAR长度与功能的线性关系。

总结

该研究通过多种尖端技术深入分析了核仁超微结构与RNA分选机制，提出了FBL介导的动态过程对DFC形成的关键作用，为RNA代谢的空间组织研究提供了全新视角。