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作者及研究机构

本研究的作者包括Jun Kan、Biqian Fu、Ruisheng Zhou、Daihan Zhou、Yufang Huang、Hongwei Zhao、Yunlong Zhang、Yuming Rong、Jun Dong、Liangping Xia、Shanshan Liu、Qiuling Huang、Nannan Wang、Na Ning、Bei Zhang和Enxin Zhang。研究机构包括中山大学肿瘤防治中心、广州中医药大学第一附属医院、广州医科大学基础医学院、广州白云山中一药业有限公司以及广州中医药大学深圳医院（福田）。该研究于2021年10月24日在线发表在《Phytomedicine》期刊上，文章编号为153821。

学术背景

非小细胞肺癌（NSCLC）是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，现有的治疗方法包括手术切除、化疗、放疗、靶向治疗和免疫治疗。传统中药（TCM）作为肺癌的辅助治疗手段，逐渐受到关注。周岱翰教授是中国著名的中医肿瘤专家，他基于50多年的临床经验，开发了用于治疗支气管肺癌和肺转移癌的中药配方——荷蟾片（He-Chan Pian, HCP）。HCP在治疗气虚、阴虚、痰瘀、毒滞型的非小细胞肺癌中显示出一定的疗效。然而，HCP抗肿瘤作用的具体分子机制尚不明确。本研究旨在探讨HCP通过miR-205-5p介导的GREM1/RAP1信号通路抑制非小细胞肺癌转移的机制。

研究流程

1. 动物实验
   研究使用了40只5周龄的BALB/c裸鼠，通过皮下注射A549非小细胞肺癌细胞建立肿瘤模型。小鼠被随机分为五组：模型组（生理盐水）、HCP低剂量组（1.37 g/kg）、HCP中剂量组（2.74 g/kg）、HCP高剂量组（5.48 g/kg）和阳性对照组（顺铂，2 mg/kg）。每组小鼠连续给药21天，随后进行肿瘤体积、体重、肝脏和肾脏指数的测量，并对肿瘤、肝脏和肾脏进行组织学检查。

2. 超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）分析
   在实验第21天，采集模型组和HCP高剂量组小鼠的血清，使用UPLC-MS分析血清中的草药成分和代谢物。共鉴定出36种主要成分和代谢物，其中10种单体具有抗肿瘤功能。

3. 蛋白芯片和转录组测序分析
   对模型组和HCP高剂量组的肿瘤组织进行蛋白芯片和转录组测序分析，筛选差异表达的蛋白质和基因。通过miRNA靶点预测分析，发现miR-205-5p可能调控GREM1的表达。

4. 细胞实验
   使用短发夹RNA（shRNA）和过表达质粒在A549细胞中调控GREM1的表达，通过CCK-8、伤口愈合和Transwell实验评估细胞增殖、迁移和侵袭能力。Western blotting检测上皮-间质转化（EMT）相关蛋白和RAP1信号通路相关蛋白的表达水平。

5. 双荧光素酶报告基因实验
   构建野生型和突变型GREM1的荧光素酶报告基因质粒，验证miR-205-5p与GREM1的直接相互作用。

6. 异种移植实验
   在裸鼠中建立A549细胞异种移植模型，评估GREM1过表达对肿瘤生长的影响，并观察HCP的抑制作用。

主要结果

1. HCP抑制肿瘤生长
   HCP显著降低了肿瘤体积和重量，且对肝脏和肾脏无毒性作用。HCP高剂量组的肿瘤抑制率为29.38%，顺铂组为36.40%。

2. HCP抑制EMT和GREM1表达
   Western blotting结果显示，HCP高剂量组显著降低了Vimentin、N-cadherin和Snail的表达，增加了E-cadherin的表达。蛋白芯片分析显示，模型组中GREM1的表达显著高于HCP高剂量组。

3. GREM1促进肿瘤转移
   GREM1过表达显著促进了A549细胞的迁移和侵袭能力，并激活了RAP1信号通路。shRNA抑制GREM1则产生了相反的效果。

4. miR-205-5p调控GREM1
   双荧光素酶报告基因实验证实，miR-205-5p直接结合GREM1的3’UTR，负调控其表达。

5. HCP抑制GREM1过表达肿瘤的生长
   在异种移植模型中，GREM1过表达并未显著促进肿瘤生长，但HCP显著抑制了肿瘤体积和重量。

结论

本研究揭示了HCP通过miR-205-5p介导的GREM1/RAP1信号通路抑制非小细胞肺癌转移的机制。HCP通过抑制GREM1的表达，阻断RAP1信号通路的激活，从而抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。研究结果为HCP在非小细胞肺癌治疗中的应用提供了科学依据，并为开发新的抗肿瘤药物提供了潜在靶点。

研究亮点

1. 重要发现
   本研究首次揭示了HCP通过miR-205-5p/GREM1/RAP1信号通路抑制非小细胞肺癌转移的分子机制。

2. 方法创新
   研究结合了UPLC-MS、蛋白芯片、转录组测序和双荧光素酶报告基因实验等多种技术手段，全面解析了HCP的抗肿瘤作用机制。

3. 应用价值
   研究结果为HCP在非小细胞肺癌治疗中的应用提供了理论支持，并为开发新的抗肿瘤药物提供了潜在靶点。

其他有价值的内容

本研究还鉴定出HCP中的10种具有抗肿瘤功能的单体成分，如Cearoin、Sarracenin、Resibufogenin等，这些成分的抗肿瘤作用机制为后续研究提供了重要线索。