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主要作者及机构
本研究由Lei Zhang、Xiu-Ling Ma、Quan Zhang、Chang-Le Ma、Ping-Ping Wang、Yu-Fei Sun、Yan-Xiu Zhao和Hui Zhang共同完成。研究团队来自中国山东师范大学的植物逆境研究重点实验室。该研究于2001年发表在期刊《Gene》上。
学术背景
本研究的主要科学领域是植物逆境生物学，特别是植物对高盐胁迫的耐受性研究。由于植物对渗透胁迫的响应具有高度的遗传复杂性，过去的研究在提高植物耐受性方面取得的成功有限。因此，本研究旨在通过大规模测序随机选择的cDNA克隆或表达序列标签（expressed sequence tags, ESTs），快速发现与盐胁迫相关的基因，从而为理解植物对盐胁迫的响应提供基础。
研究选择了碱蓬（Suaeda salsa）作为模型植物，因为这种植物能够在海水水平的盐度下生存，是研究耐盐机制的理想模型。通过构建一个经过NaCl处理的碱蓬cDNA文库，并进行大规模测序，研究团队希望能够鉴定出与盐胁迫相关的新基因，并为未来的功能基因组学研究提供数据支持。
详细工作流程
本研究的工作流程主要包括以下几个步骤：
1. RNA提取与cDNA文库构建
研究人员首先将碱蓬幼苗用Hoagland溶液培养约4周，然后用400 mM NaCl处理48小时。处理后，收集地上部分组织，在液氮中研磨，使用RNagent提取总RNA，并通过MessageMaker Kit选择poly(A)+ RNA。随后，使用oligo-dT linker-primer进行第一链cDNA合成，并在5’端连接带有EcoRI兼容末端的适配器。cDNA被单向插入到l-ZAP Express载体的EcoRI和XhoI位点，进行体外包装和扩增，最终构建了一个包含约10^6个重组子的cDNA文库。
测序
将噬菌体文库通过大规模切割转化为质粒形式，并感染大肠杆菌XLOLR菌株。细菌培养45分钟后，在含有四环素和卡那霉素的培养基上低密度接种，并在37°C过夜培养。随机选择单个菌落进行质粒DNA纯化和测序。所有测序反应均使用标准T3测序引物，并通过毛细管自动测序机（Perkin-Elmer）进行分析。
序列编辑与同源性比较
测序数据在Macintosh操作系统上进行初步分析和组装。使用SeqClip程序去除前导载体序列和低质量序列，异常克隆序列则通过手动编辑。每个编辑后的EST序列被翻译为六个阅读框，并与NCBI的非冗余数据库进行BLASTX比对，以鉴定其同源性。对于没有显著相似性的序列，进一步使用BLASTN进行比对。
数据分析与结果分类
研究人员对1016个可读序列进行了分析，其中773个序列与已知基因具有同源性，227个序列匹配未知的蛋白质编码区，16个异常序列或细菌来源的序列被排除。最终，研究人员鉴定了492个独特的克隆，其中315个与已知基因同源，177个匹配未知的蛋白质编码区（其中101个在其他生物中已有发现，76个为完全新发现的序列）。
主要结果
1. EST序列的鉴定与分类
通过测序和同源性分析，研究人员获得了492个独特的EST序列。这些序列被分为11个功能类别，包括细胞壁、细胞骨架、膜运输、细胞分裂、防御、染色体代谢、信号传导、基因表达与RNA代谢、蛋白质代谢与分选、光合作用和代谢相关基因。
盐胁迫相关基因的鉴定
研究人员还特别关注了与盐胁迫耐受性相关的基因，并将其分为八类，包括渗透保护剂生物合成基因、活性氧清除剂、应激蛋白、转运蛋白、膜流动性相关基因、信号传导组分、转录调控基因和光合作用相关基因。
高表达基因的发现
通过数字Northern分析，研究人员发现了六个高表达的基因，包括甲硫氨酸合酶、蛋白激酶、果糖二磷酸醛缩酶、叶绿素a/b结合蛋白、翻译延伸因子和液泡H+-ATP酶基因。这些基因的高表达反映了盐胁迫下植物的活跃生长状态。
结论
本研究通过构建碱蓬的cDNA文库并进行大规模测序，成功鉴定了大量与盐胁迫相关的基因，包括已知基因和全新的未知基因。这些结果为理解植物对盐胁迫的分子机制提供了重要数据支持，并为未来的功能基因组学研究奠定了基础。此外，本研究还揭示了碱蓬在高盐环境下的独特耐受机制，特别是其通过液泡Na+/H+逆向转运蛋白将钠离子隔离到液泡中的能力。这些发现不仅具有重要的科学价值，还为通过基因工程提高作物的耐盐性提供了潜在的靶点。
研究亮点
1. 大规模EST测序
本研究通过大规模测序随机选择的cDNA克隆，快速发现了大量与盐胁迫相关的基因，为后续的功能基因组学研究提供了丰富的数据资源。
新基因的发现
研究团队成功鉴定了76个全新的未知蛋白质编码序列，这些序列可能代表了碱蓬独特的耐盐机制。
盐胁迫相关基因的全面分析
研究人员不仅鉴定了与盐胁迫相关的基因，还对其进行了功能分类，为理解植物对盐胁迫的复杂响应提供了全面的视角。
高表达基因的发现
通过数字Northern分析，研究人员发现了六个在高盐胁迫下高表达的基因，这些基因可能对碱蓬的耐盐性具有重要贡献。
其他有价值的内容
本研究的EST数据已公开发布在互联网上，为其他研究人员提供了宝贵的数据资源。此外，研究人员还提出了一些未来研究的方向，例如通过基因工程手段将碱蓬的耐盐基因转入其他作物，以提高其耐盐性。