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该研究由Rocío Castellanos-Rueda、Raphaël B. Di Roberto、Florian Bieberich等作者共同完成，主要来自ETH Zürich、University of Basel等机构。研究于2022年10月发表在《Nature Communications》期刊上。
该研究的主要科学领域是免疫疗法，特别是嵌合抗原受体T细胞（Chimeric Antigen Receptor T cells, CAR-T cells）的工程化改进。CAR-T细胞疗法在治疗血液系统恶性肿瘤方面取得了显著进展，但在实体瘤治疗中效果有限。CAR-T细胞的功能主要依赖于其信号传导域（signaling domains），但目前仅有少数信号传导域被探索。因此，本研究旨在通过信号传导域的重组和单细胞测序技术，开发一种名为“SPEEDCARs”的方法，以加速CAR-T细胞的工程化，并扩展其信号传导域的组合空间，从而增强CAR-T细胞在肿瘤治疗中的效果。
CAR信号传导域库的设计与生成
研究人员设计了一个模块化的克隆和组装策略，通过重组细胞内信号传导元件，生成了一个包含180种独特CAR变体的库。这些变体通过CRISPR-Cas9技术整合到原代人类T细胞中。信号传导域库的设计保留了CD3ζ信号传导域的三个免疫受体酪氨酸激活基序（ITAMs），以确保功能最大化。
CAR-T细胞的功能筛选
研究人员将表达CAR库的T细胞与HER2阳性的肿瘤细胞（SKBR3）共培养，随后进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞CAR测序（scCAR-seq）。通过这种方法，研究人员能够高通量筛选出具有肿瘤杀伤特性的CAR变体，并分析其诱导的T细胞表型。
CAR变体的转录组分析
通过scRNA-seq数据，研究人员对CAR变体诱导的T细胞转录表型进行了详细分析。他们使用无监督聚类方法将细胞分为不同的簇，并根据CD4和CD8表达、细胞周期阶段以及T细胞标记基因的差异表达对簇进行注释。此外，研究人员还通过基因集评分和主成分分析（PCA）等方法，进一步评估了不同CAR变体的功能特性。
CAR-T细胞与肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的转录组比较
为了评估CAR变体在临床环境中的潜在应用价值，研究人员将CAR-T细胞的scRNA-seq数据与来自非小细胞肺癌（NSCLC）患者的TILs数据进行了比较。通过这种转录组映射，研究人员能够识别出与肿瘤反应性TILs相似的CAR变体，这些变体可能在实体瘤治疗中具有潜在的应用价值。
CAR变体的功能验证
基于scRNA-seq数据和转录组映射结果，研究人员选择了10种CAR变体进行功能验证。通过多参数流式细胞术、活细胞成像和细胞因子分泌实验，研究人员评估了这些变体的T细胞分化、细胞毒性和细胞因子分泌特性。结果表明，某些CAR变体在肿瘤杀伤能力和T细胞表型方面表现出优于标准CAR的特性。
CAR信号传导域库的生成与表达
研究人员成功生成了一个包含179/180种可能组合的CAR信号传导域库，并通过CRISPR-Cas9技术将其整合到原代人类T细胞中。流式细胞术验证了CAR在T细胞表面的表达及其与HER2抗原的结合能力。
CAR-T细胞的功能筛选与转录组分析
scRNA-seq和scCAR-seq数据揭示了不同CAR变体诱导的T细胞转录表型的多样性。研究人员识别出多个与肿瘤杀伤特性和T细胞表型相关的CAR变体，并发现这些变体在CAR诱导的簇（CICs）中显著富集。
CAR-T细胞与TILs的转录组比较
通过将CAR-T细胞的转录组数据与TILs数据进行比较，研究人员识别出多个与肿瘤反应性TILs相似的CAR变体。这些变体在肿瘤浸润和抗肿瘤反应中可能具有潜在的应用价值。
CAR变体的功能验证
功能验证实验表明，某些CAR变体在肿瘤杀伤能力和T细胞表型方面表现出优于标准CAR的特性。例如，某些变体在细胞毒性实验中表现出更快的肿瘤杀伤动力学，并且在细胞因子分泌实验中显示出较低的促炎因子分泌水平。
本研究开发了一种名为“SPEEDCARs”的集成方法，通过信号传导域重组和单细胞测序技术，扩展了CAR-T细胞的信号传导域组合空间，并识别出多个具有潜在应用价值的CAR变体。这些变体在肿瘤杀伤能力和T细胞表型方面表现出优于标准CAR的特性，可能为CAR-T细胞疗法在实体瘤治疗中的应用提供新的可能性。
本研究还探讨了不同信号传导域组合对CAR-T细胞功能的影响，并发现某些信号传导域（如CD79b和Fc受体域）在诱导T细胞增殖和肿瘤杀伤能力方面表现出显著的优势。这些发现为进一步优化CAR-T细胞的设计提供了重要的理论依据。