本研究由Ruo-Lan Li、Qing Zhang、Jia Liu、Jia-Yi Sun、Li-Ying He、Hu-Xinyue Duan、Wei Peng和Chun-Jie Wu共同完成，研究团队来自成都中医药大学药学院。该研究于2020年7月9日发表在《Oxidative Medicine and Cellular Longevity》期刊上，文章标题为“Hydroxy-α-Sanshool Possesses Protective Potentials on H2O2-Stimulated PC12 Cells by Suppression of Oxidative Stress-Induced Apoptosis Through Regulation of PI3K/Akt Signal Pathway”。
学术背景
氧化应激与神经退行性疾病（如帕金森病和阿尔茨海默病）密切相关。过量的活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）是导致氧化应激的主要原因之一，ROS如过氧化氢（H2O2）、超氧化物阴离子和羟基自由基等，会导致细胞结构损伤，包括脂质过氧化、DNA和蛋白质氧化，进而破坏细胞的正常功能和形态。细胞内有多种抗氧化系统，主要通过清除细胞内ROS来防止氧化损伤。酶类如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是关键的抗氧化防御机制。过量的ROS不仅与线粒体功能障碍密切相关，还会增加细胞内Ca2+浓度，激活细胞内凋亡通路，其中PI3K/Akt信号通路与这一过程密切相关。
花椒（Zanthoxylum bungeanum）是一种常用的中草药，具有抗炎、镇痛、改善学习和记忆能力的作用。羟基-α-山椒素（Hydroxy-α-Sanshool, HAS）是花椒果皮中最重要的活性成分之一。本研究的目的是利用H2O2刺激的PC12细胞模型，探讨HAS的神经保护作用及其相关机制。
研究流程
- 细胞培养与处理：PC12细胞在含有5%胎牛血清（FBS）和5%马血清（HS）的RPMI-1640培养基中培养。细胞用不同浓度的HAS（15、30、60 μM）预处理2小时，然后用90 μM H2O2处理4小时。
- 细胞活力测定：使用CCK-8试剂盒测定细胞活力。首先检测HAS对正常PC12细胞的细胞毒性，然后选择最佳工作浓度和时间进行后续实验。
- 细胞凋亡检测：通过DAPI染色和流式细胞术（Annexin V-FITC/PI染色）评估细胞凋亡。JC-1探针用于检测线粒体膜电位（MMP）的变化。
- 细胞内ROS检测：使用荧光探针DCFH-DA检测细胞内ROS的积累。
- 氧化应激相关酶活性测定：测定MDA含量以及SOD、CAT和GSH-Px的活性。
- Western Blotting实验：检测PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3的表达水平。
- 信号通路抑制实验：使用PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002，进一步验证HAS的保护作用是否通过该通路实现。
主要结果
- HAS对H2O2刺激的PC12细胞的保护作用：CCK-8实验结果显示，HAS显著提高了H2O2刺激的PC12细胞的存活率，且对正常PC12细胞无明显毒性。
- HAS抑制H2O2诱导的细胞凋亡：DAPI染色和流式细胞术结果显示，HAS显著减少了H2O2诱导的细胞凋亡，且呈浓度依赖性。JC-1探针检测显示，HAS能够逆转H2O2引起的线粒体膜电位下降。
- HAS减少细胞内ROS积累：荧光探针DCFH-DA检测结果显示，HAS显著降低了H2O2诱导的细胞内ROS积累。
- HAS增强抗氧化酶活性：HAS显著提高了SOD、CAT和GSH-Px的活性，同时降低了MDA的含量。
- HAS调节凋亡相关蛋白的表达：Western Blotting结果显示，HAS上调了Bcl-2、p-PI3K、Akt和p-Akt的表达，下调了Bax和cleaved caspase-3的表达。
- PI3K/Akt信号通路的作用：使用LY294002抑制PI3K/Akt信号通路后，HAS的保护作用显著减弱，表明HAS通过PI3K/Akt信号通路发挥其保护作用。
结论
本研究首次证明了HAS通过抑制氧化应激诱导的细胞凋亡，对H2O2刺激的PC12细胞具有保护作用，其机制涉及PI3K/Akt信号通路的调控。HAS通过减少ROS积累、增强抗氧化酶活性、调节凋亡相关蛋白的表达，显著提高了PC12细胞的存活率。研究结果为HAS在神经退行性疾病治疗中的应用提供了科学依据。
研究亮点
- 重要发现：HAS通过PI3K/Akt信号通路抑制氧化应激诱导的细胞凋亡，具有显著的神经保护作用。
- 方法创新：本研究首次利用H2O2刺激的PC12细胞模型，系统探讨了HAS的神经保护机制。
- 研究对象的特殊性：HAS作为花椒果皮中的主要活性成分，具有广泛的药理活性，本研究为其在神经退行性疾病中的应用提供了新的证据。
其他有价值的内容
本研究还通过信号通路抑制实验，进一步验证了HAS的保护作用依赖于PI3K/Akt信号通路，为后续研究提供了重要的实验依据。此外，研究结果提示HAS可能作为一种新型的神经保护剂，具有潜在的临床应用价值。