本研究由Atsushi Kurata等作者团队完成，主要来自日本近畿大学（Kindai University）应用生物化学系，研究结果于2022年发表在《Scientific Reports》期刊上。该研究聚焦于Lactiplantibacillus plantarum（原名为Lactobacillus plantarum）产生的细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）的特性及其对宿主免疫细胞的影响。研究背景基于肠道微生物群与宿主免疫系统之间的复杂相互作用，特别是益生菌通过EVs调节肠道免疫的机制尚未完全阐明。研究旨在揭示L. plantarum EVs的物理化学特性、生化成分及其对免疫细胞的激活作用，特别是通过Toll样受体2（TLR2）识别EVs中的脂蛋白（Lipoprotein, LP）来激活免疫反应的机制。
肠道微生物群由复杂的细菌群落组成，这些细菌通过刺激肠道免疫系统来维持宿主的胃肠道稳态。益生菌作为有益的肠道共生菌，能够通过M细胞（Microfold cells）进入肠道固有层，进而诱导免疫反应。EVs是细菌释放的纳米级囊泡，携带代谢中间产物、蛋白质和RNA等物质，能够刺激宿主免疫细胞。尽管EVs在宿主免疫系统中的功能备受关注，但其具体的免疫刺激分子仍不明确。因此，本研究旨在通过全面分析L. plantarum EVs的生化成分，揭示其免疫调节机制。
研究分为多个步骤，详细流程如下：
EVs的制备与物理化学特性分析
研究首先从L. plantarum JCM8341的培养上清液中分离EVs，通过差速离心和超速离心获得EVs沉淀。使用透射电子显微镜（TEM）观察EVs的形态，确认其直径为约50 nm的球形结构。通过荧光染料FM4-64标记EVs的细胞质膜，利用荧光纳米颗粒追踪分析（NTA）量化EVs的数量和大小。结果显示，L. plantarum EVs的尺寸范围为50-800 nm，且存在单体和多聚体结构。此外，研究还测定了EVs的Zeta电位，表明EVs在溶液中呈弱电性。
EVs的生化成分分析
研究通过代谢组学、蛋白质组学和RNA测序（RNA-seq）全面分析了L. plantarum EVs的生化成分。代谢组学分析检测到1519种化合物，包括脂肪酸、NAD+、氨基酸和核酸等。蛋白质组学分析鉴定了411种蛋白质，其中大部分定位于细胞质膜和细胞质。RNA-seq分析显示，EVs中的小RNA主要来源于5S、16S和23S rRNA，且RNA被EVs包裹，能够抵抗RNase的降解。
EVs对免疫细胞的影响
研究使用RAW264细胞和Peyer’s patch（PP）细胞评估EVs对免疫细胞的激活作用。结果显示，L. plantarum EVs能够诱导RAW264细胞产生促炎性细胞因子（如IL-1β和IL-6）和抗炎性细胞因子（如IL-10），并促进PP细胞产生免疫球蛋白A（IgA）。此外，EVs还诱导了IFN-γ和IL-12的产生，表明其能够激活先天性和获得性免疫反应。
EVs的受体识别与配体鉴定
研究进一步探讨了宿主细胞如何识别L. plantarum EVs。通过HEK293细胞表达TLRs和NLRs，研究发现EVs主要通过TLR2识别，并激活NF-κB信号通路。研究还鉴定了一种新型脂蛋白LP19180，其N端酰化肽能够被TLR2识别并激活NF-κB。这一发现揭示了L. plantarum EVs通过TLR2识别LP19180的免疫刺激机制。
EVs在胃肠道中的检测
研究首次在大鼠胃肠道中检测到大量EVs，其平均粒径为160 nm，模式粒径为132 nm。这一发现表明，益生菌释放的EVs可能在肠道免疫调节中发挥重要作用。
研究的主要结果包括：
1. L. plantarum EVs具有细胞质膜结构，主要包含细胞质代谢物、膜蛋白和细胞质蛋白，但不含细菌细胞壁成分（如脂磷壁酸和肽聚糖）。
2. EVs能够激活RAW264细胞和PP细胞，诱导促炎性和抗炎性细胞因子的产生，并促进IgA的分泌。
3. EVs通过TLR2识别LP19180的N端酰化肽，激活NF-κB信号通路。
4. 在大鼠胃肠道中检测到大量EVs，表明EVs可能在肠道免疫调节中发挥重要作用。
本研究首次全面揭示了L. plantarum EVs的物理化学特性、生化成分及其对宿主免疫细胞的激活机制。研究发现，EVs通过TLR2识别LP19180的N端酰化肽，激活NF-κB信号通路，进而诱导先天性和获得性免疫反应。这一发现不仅深化了我们对益生菌EVs免疫调节机制的理解，还为开发基于EVs的免疫调节剂提供了新的思路。此外，研究首次在大鼠胃肠道中检测到大量EVs，为肠道免疫调节的研究提供了新的视角。
研究还探讨了EVs在肠道免疫调节中的潜在应用价值，特别是通过TLR2激活免疫反应的机制，为开发基于EVs的免疫调节剂提供了理论依据。此外，研究还提出了进一步研究的方向，包括EVs在肠道免疫调节中的具体作用机制及其在疾病治疗中的潜在应用。