本文由Jia‑yi Zhang、Wei‑wen Zhu、Meng‑yao Wang、Run‑dong Zhai、Qiong Wang、Wei‑li Shen和Lai‑kui Liu组成的研究团队完成，隶属于中国南京医科大学口腔医院口腔基础医学科，其所属机构包括江苏省口腔疾病重点实验室及江苏省口腔医学转化工程研究中心。研究成果发表在2021年《Journal of Translational Medicine》上，文章编号为19:513，DOI链接为https://doi.org/10.1186/s12967-021-03181-x。
口腔癌是世界上第六大最常见癌症，其中口腔鳞状细胞癌(OSCC, oral squamous cell carcinoma)占口腔恶性肿瘤的90%。尽管诊断和治疗技术有所进步，但OSCC患者的五年生存率仍较低，主要原因是远处转移和术后复发。因此，迫切需要深入研究OSCC的复杂发病机制，以开发更有效的治疗技术。肿瘤微环境(TME, tumor microenvironment)作为导致肿瘤进展的重要因子，包含由细胞外基质(ECM, extracellular matrix)以及结构性网状物组成的复杂网络。CAF (Cancer-Associated Fibroblasts, 癌症相关成纤维细胞)作为TME中的主要细胞种类，被认为能通过ECM的生产和基质重塑显著影响肿瘤的发展。此外，ECM刚度(stiffness)这一力学特性近年来成为研究的热点，相关研究表明ECM刚度变化能够通过多种信号通路影响肿瘤细胞的侵袭和转移。尽管已有部分研究关注ECM主要成分胶原(collagen)与LOX (Lysyl Oxidase, 赖氨酸氧化酶)在包括乳腺癌、结肠癌及肝癌等实性瘤中的作用，但CAF与LOX及胶原的协同作用在OSCC中的相关机制尚未被完全揭示。本研究提出了一个假设模型，即CAF通过高表达LOX对肿瘤基质中胶原的交联及刚度产生影响，从而通过FAK (Focal Adhesion Kinase, 黏着斑激酶)信号通路促进OSCC的恶化。
研究按照以下工作流程逐步开展：
临床样本分析与免疫组化检测
研究收集了96例2010年至2015年间南京医科大学附属口腔医院手术治疗的原发性OSCC患者组织标本，这些患者未接受术前化疗或放疗。通过多重免疫组化(IHC)染色技术检测CAF标志物(如α-SMA和FAP)和LOX在肿瘤基质中的共定位，并通过Kaplan-Meier生存曲线等统计模型分析LOX表达与OSCC分期、病理分级及患者预后的相关性。
CAF的分离和LOX干扰实验
在新鲜OSCC组织和配对的正常组织中分离CAF和NF (Normal Fibroblasts, 正常成纤维细胞)，并通过RT-qPCR和Western Blot验证LOX在CAF中的高表达水平。使用含LOX-shRNA的慢病毒进行LOX敲低实验，并通过CCK-8检测细胞增殖、划痕实验检测迁移能力以及Transwell实验检测侵袭能力，进一步验证CAF衍生的LOX在OSCC生物学行为中的作用。
CAF对基质胶原重塑及刚度的影响
为研究CAF经由LOX对胶原交联的调控，研究构建了CAF-胶原共培养系统，利用微红外流变仪(MARS60 Rheometer)测量胶原基质的刚度(弹性模量)。同时，通过扫描电子显微镜(SEM)观察胶原孔径变化，并结合LOX敲低及其抑制剂BAPN的干预，分析CAF对胶原重塑的贡献。
LOX介导的基质刚度对OSCC生物行为的影响
利用CAF条件培养基(CM)处理胶原以模拟不同刚度环境，将OSCC细胞培养于这些基质上并通过3D共培养系统观察侵袭深度及细胞形态变化，结合与FAK磷酸化相关的信号检测，探索基质刚度变化对OSCC细胞生物行为及EMT (Epithelial-Mesenchymal Transition, 上皮间质转化)的影响。
信号机制分析
为进一步明确LOX介导的基质刚度-FAK信号-EMT链条，研究使用FAK选择性小分子抑制剂FAK Inhibitor 14 (Faki)，观察抑制FAK磷酸化对OSCC细胞功能及Wnt/β-catenin相关信号的调控作用。
LOX与CAF的共定位及预测意义
IHC染色显示LOX与CAF标志物α-SMA及FAP高度共定位于OSCC肿瘤基质中，LOX高表达与临床晚期及较差的预后显著相关(Kaplan-Meier生存分析，P < 0.001)。此外，表明LOX在OSCC中是潜在的不良预后标志物。
CAF-LOX对OSCC细胞生物行为的促进作用
LOX高表达在CAF中得以验证。LOX敲低后CAF影响OSCC细胞的促进效应显著减弱，包括增殖、迁移、侵袭能力下降，以及EMT相关标志物N-cadherin及Vimentin表达下调，而E-cadherin表达上调。
CAF-LOX对胶原基质重塑的关键作用
LOX通过催化胶原交联显著增强CAF处理后的胶原收缩能力，增加其密度、提升刚度(弹性模量显著升高，P < 0.0001)。
基质刚度对肿瘤行为及信号通路的影响
CAF衍生的高刚度胶原显著增加OSCC细胞的侵袭深度和形态变形，诱导FAK磷酸化及EMT通路(Western Blot结果显示N-cadherin及Vimentin上调，E-cadherin下调)，并进一步激活Wnt/β-catenin信号链。同时，FAK抑制剂能有效逆转高刚度诱导的肿瘤侵袭及信号激活。
本研究系统揭示了CAF高表达LOX通过胶原交联及刚度变化促进OSCC进展的重要机制，明确了LOX-FAK信号轴在上皮间质转化中的功能。该机制为OSCC侵袭性行为提供了新的分子解释，并提出LOX可作为OSCC早期诊断及干预治疗的潜在靶点。