学术报告

这篇文章由 Wenping Yang, Dan Li 等多位作者完成，并由 Haixue Zheng 联络，来自中国农业科学院兰州兽医研究所的 State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology 和 OIE/National Foot and Mouth Disease Reference Laboratory。此研究发表于 2020年1月29日，并投稿于 Journal of Virology，DOI:10.1128/jvi.02086-19。本研究是一项针对口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus, FMDV）中3a蛋白的机制性研究，其重点阐述了如何通过自噬相关途径抑制宿主的抗病毒免疫应答。

研究背景

口蹄疫病毒（FMDV）是全球畜牧业中具有高度破坏性的病原体，对经济带来了巨大损失。该病毒属于 Picornaviridae 家族 Aphthovirus 属，其基因组为单股正链RNA，长度约为8.5 kb。FMDV编码多种结构与非结构蛋白（如VP1-4、3A、3C^pro 等）以帮助病毒在宿主中高效复制。在自然感染中，宿主的先天免疫，包括 I 型干扰素（Type I Interferons, IFNs）产生是应对病毒的重要防御机制。而RIG-I样受体（RIG-I-like Helicases, RLHs，包含RIG-I和MDA5）在检测RNA病毒侵袭中至关重要。然而，为了成功建立感染，FMDV进化出多种策略逃逸或抑制先天免疫。本研究主要探索FMDV 3a 蛋白是否通过自噬途径调控RLH信号传导，及其如何抑制宿主的免疫应答。

研究流程

本研究包含多个实验流程，综合利用了 分子生物学技术、细胞水平分析 和 免疫学实验 来揭示FMDV 3a蛋白的分子机制：

1. 对象及基因克隆

研究中使用了HEK293T人胚肾细胞、猪肾细胞PK-15及猪肺泡巨噬细胞（PAM）。通过PCR从FMDV感染的细胞中提取目标基因，包括3a、RIG-I、MDA5、G3BP1（Ras-GAP SH3结合蛋白1）和LRRC25（Leucine Rich Repeat-Containing Protein 25），并分别构建到携带标签（如Flag、Myc）的真核表达载体中，随后在HEK293T细胞中进行瞬时转染。

2. FMDV 3a与G3BP1的相互作用分析

分析显示，FMDV非结构蛋白3a通过免疫共沉淀（co-IP）与G3BP1蛋白直接相互作用。这一结论通过在多种细胞系中的免疫共沉淀实验和共聚焦显微镜观察了3a蛋白与G3BP1的共定位得到验证。

3. FMDV 3a对宿主RLHs信号通路的抑制

利用双荧光素酶报告基因实验，研究发现FMDV 3a蛋白显著抑制了触发下游IFN-β启动子的活化。此外，使用野生型和功能缺失突变体的3a蛋白，也观察到类似的抑制作用，表明其与RIG-I与MDA5信号的抑制密切相关。

4. 3a蛋白抑制的机制：自噬通路的参与

通过Western blot实验检测蛋白降解途径，研究发现FMDV 3a通过上调自噬相关蛋白LRRC25促进G3BP1的分解。特别是，3-MA（一种自噬抑制剂）特异性阻止了FMDV 3a对G3BP1的降解，而其他抑制剂如MG132（蛋白酶体抑制剂）和NH4Cl（溶酶体抑制剂）未见此效应。

5. LRRC25蛋白在FMDV复制中的功能

研究进一步证明，通过RNA干扰沉默LRRC25表达大幅抑制了FMDV的基因组复制和病毒滴度。此外，LRRC25过表达能增强FMDV复制，表明LRRC25在病毒的增殖过程中起关键作用。

6. 其他小核糖病毒（Picornaviruses）3a蛋白的研究

为了探讨其他小核糖病毒是否共享相似机制，研究检测了EV71、SVV和EMCV等病毒的3a蛋白。结果显示，这些病毒的3a蛋白同样通过上调LRRC25诱导G3BP1的降解，支持了3a蛋白在病毒中进化保守性的假设。

实验结果及支持数据

1. 3a与G3BP1的直接相互作用
   通过免疫共沉淀和免疫荧光实验验证了FMDV 3a与G3BP1的共定位与相互作用。

2. 3a抑制RLH信号传导
   FMDV 3a蛋白抑制IFN-β和相关下游抗病毒基因的表达，与野生型和突变型的3a实验结果一致。

3. 3a通过LRRC25调控自噬降解G3BP1
   在FMDV感染过程中，LRRC25的表达显著上升，自噬抑制剂能阻断G3BP1降解。

4. LRRC25促进FMDV复制
   过表达LRRC25增强病毒复制，而LRRC25的RNA干扰抑制病毒滴度，为病毒与宿主相互作用提供了机制支持。

5. 小核糖病毒3a蛋白的保守性
   其他小核糖病毒的3a蛋白都表现出类似的上调LRRC25以抑制宿主免疫的现象。

研究结论和意义

本研究首次揭示了FMDV 3a蛋白通过上调LRRC25诱导自噬途径降解核糖结合蛋白G3BP1，从而抑制RIG-I/MDA5介导的抗病毒免疫信号，并促进病毒复制。该机制阐明了FMDV逃逸宿主免疫系统的新策略，深化了对病毒与宿主免疫相互作用的理解。

从应用角度来看，这些发现为FMDV疫苗的优化设计提供了新思路，并可能促成新型抗病毒药物的研发。研究还提示了G3BP1和LRRC25在病毒感染中的潜在作用，有助于跨病毒研究中的机制推广。

研究亮点

1. 首次揭示FMDV 3a调控自噬降解G3BP1的机制，填补了领域空白。
2. 创新性强调LRRC25作为病毒调控免疫信号的关键分子，为进一步研究其功能提供了方向。
3. 发现小核糖病毒3a蛋白在宿主免疫逃逸中的进化保守性。

价值与未来展望

研究的重要意义不仅仅局限于口蹄疫病毒，还为探索其他RNA病毒如何通过自噬和宿主蛋白调控免疫提供参考。同时，LRRC25和G3BP1的功能深入研究可能揭示更多病毒与宿主互作的分子机制，为多种病毒感染的控制和治疗提供理论支持。