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作者与机构
本研究的作者包括Yaofeng Wang、Yifan Zhao、Shubin Chen、Xiaoming Chen、Yanmei Zhang、Hong Chen、Yuansong Liao、Jiashu Zhang、Di Wu、Hongxing Chu、Hongying Huang、Caixia Wu、Shijuan Huang、Huichao Xu、Bei Jia、Jie Liu、Bo Feng、Zhonghan Li、Dajiang Qin、Duanqing Pei和Jinglei Cai。研究团队来自多个机构，包括广州医科大学第五附属医院创新中心、中国科学院广州生物医药与健康研究院、香港中国科学院创新与健康研究院、四川大学生命科学学院等。研究发表于《Science Bulletin》期刊，2022年3月18日在线发表。
学术背景
本研究属于发育生物学和再生医学领域，重点关注小鼠牙齿发育过程中的细胞异质性和时空模式。牙齿发育涉及上皮-间充质相互作用，但其高分辨率的时空关系仍不清楚。研究旨在通过单细胞RNA测序（single cell RNA-seq, scRNA-seq）技术，构建小鼠牙齿发育的细胞图谱，揭示牙源性细胞的异质性和时空模式，特别是CD24+和PLAC8+细胞在牙齿再生中的潜在作用。研究目标是为再生牙科提供理论基础，推动牙齿再生技术的发展。
研究流程
研究流程包括以下几个主要步骤：
样本准备与单细胞分离
研究使用ICR小鼠胚胎的牙齿原基（tooth germ）作为研究对象，时间跨度为胚胎第10.5天（E10.5）至第16.5天（E16.5）。样本包括切牙和磨牙的牙齿原基，分别从下颌骨中分离。通过胶原酶I、胰蛋白酶和DNase I消化处理，获得单细胞悬液，并通过70微米细胞筛过滤，去除细胞碎片和聚集体。
单细胞RNA测序
使用10x Genomics Chromium平台进行单细胞RNA测序，构建文库并在Illumina NextSeq X10平台上测序。测序数据通过Cell Ranger软件进行预处理，比对到小鼠基因组（mm10），生成UMI计数矩阵。后续分析使用Scanpy、Seurat等软件进行。
数据分析与细胞轨迹推断
通过UMAP降维和Force Atlas算法，研究识别了21个细胞簇，并分为上皮细胞和间充质细胞两大群体。研究进一步分析了切牙和磨牙间充质细胞的转录组差异，发现它们在E12.5后逐渐分化为不同的细胞类型。通过RNA速度分析（RNA velocity）和基因调控网络（gene regulatory network, GRN）推断，研究揭示了牙齿发育过程中的关键调控因子和信号通路。
空间定位与功能验证
通过RNAscope原位杂交技术，研究验证了CD24+和PLAC8+细胞在牙齿原基中的空间分布。CD24+细胞主要分布在牙乳头（dental papilla, DP）的上半部分，而PLAC8+细胞位于牙乳头顶部的成牙本质细胞前体层。研究还通过流式细胞术（FACS）分离了CD24+和PLAC8+细胞，并通过组织重组实验验证了它们在牙齿再生中的功能。
牙齿再生实验
研究将CD24+和PLAC8+细胞与非牙源性上皮细胞重组，移植到小鼠肾包膜下，观察牙齿样结构的形成。结果显示，CD24+和PLAC8+细胞均能诱导牙齿再生，其中PLAC8+细胞是目前已知的最小且最均质的牙源性细胞群体。
主要结果
1. 细胞图谱与发育轨迹
研究构建了小鼠牙齿发育的单细胞图谱，揭示了上皮细胞和间充质细胞的发育轨迹。研究发现，切牙和磨牙的间充质细胞在E12.5后逐渐分化为不同的细胞类型，具有特定的转录组特征。
CD24+和PLAC8+细胞的功能
CD24+细胞分布在牙乳头的上半部分，能够分泌BMP4等信号分子，调控上皮细胞增殖和牙齿发育。PLAC8+细胞位于牙乳头顶部的成牙本质细胞前体层，具有快速细胞周期和调控上皮细胞增殖的能力。两者均能诱导非牙源性上皮细胞形成牙齿样结构。
牙齿再生实验结果
通过组织重组实验，研究证实了CD24+和PLAC8+细胞在牙齿再生中的潜力。特别是PLAC8+细胞，其体积仅为牙乳头的1/15至2/15，但能够高效诱导牙齿再生。
结论与意义
本研究通过单细胞RNA测序技术，首次构建了小鼠牙齿发育的高分辨率细胞图谱，揭示了CD24+和PLAC8+细胞在牙齿再生中的关键作用。研究结果为再生牙科提供了重要的理论基础，特别是为牙齿再生技术的开发提供了新的细胞来源和分子靶点。此外，研究还揭示了牙齿发育过程中上皮-间充质相互作用的分子机制，为理解器官发育和再生提供了新的视角。
研究亮点
1. 高分辨率单细胞图谱
研究通过大规模单细胞RNA测序，构建了小鼠牙齿发育的高分辨率细胞图谱，揭示了细胞异质性和时空模式。
CD24+和PLAC8+细胞的发现
研究首次报道了CD24+和PLAC8+细胞在牙齿再生中的功能，特别是PLAC8+细胞是目前已知的最小且最均质的牙源性细胞群体。
创新性实验方法
研究结合了单细胞RNA测序、RNAscope原位杂交、流式细胞术和组织重组实验，系统地验证了研究结果。
其他有价值的内容
研究还通过ATAC-seq技术分析了牙齿发育过程中的染色质动态变化，揭示了切牙和磨牙间充质细胞在染色质状态上的差异。此外，研究还通过微CT技术对再生牙齿的硬组织进行了三维重建和分析，进一步验证了再生牙齿的结构和功能。
这篇报告详细介绍了研究的背景、流程、结果和意义，为相关领域的研究者提供了全面的参考。