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本研究由Jesse M. Engreitz、Klara Sirokman、Patrick McDonel、Alexander A. Shishkin、Christine Surka、Pamela Russell、Sharon R. Grossman、Amy Y. Chow、Mitchell Guttman和Eric S. Lander共同完成。研究团队来自Broad Institute of Harvard and MIT、MIT的Health Sciences and Technology Division、California Institute of Technology的Division of Biology and Biological Engineering、MIT的Department of Biology以及Harvard Medical School的Department of Systems Biology。该研究于2014年9月25日发表在《Cell》期刊上。
非编码RNA（ncRNA）在生物过程中扮演着重要角色，但其分子机制尚不完全清楚。为了揭示ncRNA的功能机制，研究者开发了一种基于RNA反义纯化（RNA Antisense Purification, RAP）的系统性方法，称为RAP-RNA，用于在体内绘制RNA-RNA相互作用。该研究的目标是通过RAP-RNA技术，研究两种与RNA加工相关的ncRNA——U1小核RNA（snRNA）和MALAT1长链非编码RNA（lncRNA）——的RNA-RNA相互作用及其与染色质的定位关系。
RAP-RNA方法的开发与应用
研究者开发了三种RAP-RNA实验方案：RAP-RNA[AMT]、RAP-RNA[FA]和RAP-RNA[FA-DSG]。这些方案通过不同的交联策略捕获直接或间接的RNA-RNA相互作用。
研究对象与样本处理
研究使用小鼠胚胎干细胞（ES细胞）作为研究对象。细胞通过不同的交联剂处理后，用生物素标记的反义寡核苷酸捕获目标RNA，并通过高通量测序分析共纯化的RNA。
数据分析
测序数据通过TopHat软件比对到小鼠基因组（mm9），并使用二项分布检验进行富集分析。研究者还开发了滑动窗口分析方法，用于识别RNA-RNA相互作用的高分辨率位点。
U1 snRNA与新生pre-mRNA的相互作用
RAP-RNA[AMT]实验表明，U1 snRNA直接与pre-mRNA的5’剪接位点（5’ splice site, 5’ss）及内含子中的类似基序杂交。U1 snRNA的相互作用不仅限于5’ss，还广泛分布于整个转录本中，表明U1可能在防止pre-mRNA的过早切割和多聚腺苷酸化（PCPA）中发挥重要作用。
MALAT1 lncRNA与pre-mRNA的相互作用
RAP-RNA[FA-DSG]实验显示，MALAT1通过蛋白质中间体间接与pre-mRNA相互作用。MALAT1主要与编码RNA结合蛋白的基因的pre-mRNA相互作用，尤其是那些涉及可变剪接的基因。
RNA与染色质的定位关系
通过RAP-DNA实验，研究者发现U1和MALAT1在活性基因的染色质位点富集。U1在基因的5’端和3’端均表现出富集，而MALAT1的富集主要依赖于转录活性。转录抑制实验进一步表明，MALAT1与染色质的定位依赖于其与新生pre-mRNA的相互作用。
本研究通过开发RAP-RNA方法，系统地揭示了U1 snRNA和MALAT1 lncRNA的RNA-RNA相互作用及其与染色质的定位机制。U1通过直接杂交广泛参与pre-mRNA的剪接和PCPA保护，而MALAT1通过蛋白质中间体间接调控RNA加工。这些发现为理解ncRNA的功能机制提供了新的视角，并展示了RAP-RNA技术在研究RNA相互作用中的广泛应用潜力。
本研究还通过转录抑制实验验证了MALAT1与染色质的定位依赖于转录活性，进一步支持了MALAT1通过与新生pre-mRNA相互作用调控基因表达的模型。此外，研究还发现U1在基因5’端的富集不依赖于转录延伸，提示U1可能通过其他机制调控转录起始。
总体而言，本研究通过创新的实验方法和深入的数据分析，为ncRNA的功能和机制研究提供了重要的理论和实验基础。