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作者及研究机构

该研究由Guangwen Zhang、Min Lin、Miaomiao Qin、Qianmei Xie、Mingzhi Liang、Jinfei Jiang、Huilin Dai、Siqi Xu、Saixiang Feng和Ming Liao共同完成，研究机构为华南农业大学兽医学院。研究于2023年发表在《Journal of Agricultural and Food Chemistry》期刊上，DOI为10.1021/acs.jafc.3c00675。

学术背景

该研究的主要科学领域为微生物学与生物工程，特别是抗菌肽（antimicrobial peptides）的异源表达（heterologous expression）。研究的背景是抗生素滥用导致的耐药微生物迅速增加，尤其是大肠杆菌（Escherichia coli）、志贺氏菌（Shigella）和沙门氏菌（Salmonella）等病原体。微囊素（microcins）是一类由肠道细菌天然产生的核糖体合成的抗菌肽，分子量小于10 kDa，具有直接杀死或抑制相关细菌生长的特性。目前，微囊素J25（MccJ25）和微囊素Y（MccY）主要通过大肠杆菌表达系统生产，但该过程伴随着内毒素（endotoxins）的负面影响。因此，研究者旨在开发一种无内毒素、无抗生素抗性标记、无诱导剂且不产孢的宿主菌株，用于高效生产MccJ25和MccY，以替代抗生素和有害防腐剂。

研究流程

研究包括以下几个主要步骤：

1. 宿主菌株选择与基因簇构建
   研究者选择了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为宿主菌株，并通过启动子优化、宿主菌株选择和重组表达技术实现了MccJ25和MccY的高效表达。首先，研究者设计了MccJ25和MccY的基因簇（gene clusters），包括mcjabcd和mcyabcd基因簇，分别编码MccJ25和MccY的前体肽和翻译后修饰酶。这些基因簇被克隆到pHT43质粒中，并通过电穿孔法转化到枯草芽孢杆菌168和WB800N菌株中。

2. 启动子优化与基因簇整合
   研究者选择了五个启动子（p43、p43p、plytr、pbsp和pveg）进行优化，构建了多个表达盒（expression cassettes）。通过比较不同启动子驱动下的MccJ25和MccY表达水平，研究者发现pveg启动子对mcjbcd和mcybcd基因的表达效果最佳。随后，研究者将优化后的基因簇整合到枯草芽孢杆菌的染色体中，特别是在amyE和sigF位点进行整合，以进一步提高表达水平。

3. 微囊素表达与抗菌活性测定
   研究者通过摇瓶培养法测定了工程菌株中MccJ25和MccY的表达水平，并使用超高效液相色谱-三重四极杆质谱（UPLC-QQQ-MS）对微囊素进行定量分析。同时，通过点板法（spot-on-lawn assay）测定了MccJ25和MccY对沙门氏菌的抗菌活性。

4. 转录组分析与基因表达调控
   研究者通过定量实时PCR（qRT-PCR）和转录组分析（transcriptome analysis）研究了MccJ25和MccY基因簇的转录水平。结果表明，优化后的基因簇显著提高了mcja和mcya基因的转录水平，从而增加了微囊素的产量。

5. 动物实验验证
   研究者通过鸡模型实验验证了MccJ25和MccY对沙门氏菌感染的疗效。实验分为五组，分别给予不同处理的饲料，包括含有MccJ25或MccY的工程菌株培养上清液。结果表明，MccJ25和MccY显著降低了鸡粪便中的沙门氏菌数量。

主要结果

1. 微囊素的高效表达
   研究者成功构建了多个工程菌株，其中GWZ38菌株的MccJ25产量达到2.827 μM（5.968 mg/L），GWZ39菌株的MccY产量达到1.481 μM（3.303 mg/L）。这些产量与大肠杆菌表达系统的产量相当。

2. 抗菌活性验证
   点板法实验表明，MccJ25和MccY对沙门氏菌具有显著的抗菌活性。特别是GWZ38和GWZ39菌株的培养上清液在冷藏7天后仍保持稳定的抗菌活性。

3. 转录组分析结果
   qRT-PCR和转录组分析表明，优化后的基因簇显著提高了mcja和mcya基因的转录水平，从而增加了微囊素的产量。

4. 动物实验效果
   鸡模型实验表明，MccJ25和MccY显著降低了鸡粪便中的沙门氏菌数量，验证了其在动物体内的抗菌效果。

结论

该研究首次在枯草芽孢杆菌中实现了MccJ25和MccY的高效表达，并开发了多个无抗生素抗性标记、无诱导剂且不产孢的工程菌株。这些菌株可以直接用于食品防腐和饲料添加剂，避免了内毒素的负面影响。研究为开发新型抗菌药物和食品防腐剂提供了重要的技术支持和理论依据。

研究亮点

1. 创新性表达系统
   首次在枯草芽孢杆菌中实现MccJ25和MccY的高效表达，解决了大肠杆菌表达系统内毒素污染的问题。

2. 多基因簇整合技术
   通过将基因簇整合到染色体中的多个位点，显著提高了微囊素的产量。

3. 抗菌活性验证
   通过动物实验验证了MccJ25和MccY对沙门氏菌感染的疗效，为其在食品和饲料中的应用提供了实验依据。

其他有价值的内容

研究者还通过转录组分析揭示了微囊素基因簇的转录调控机制，为进一步优化表达系统提供了理论支持。此外，研究还探讨了微囊素在食品防腐和饲料添加剂中的潜在应用价值。