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研究作者及机构
本研究的作者包括Ying Shao、Zhao Qi、Jinhui Sang、Zhaorong Yu、Min Li、Zhenyu Wang、Jian Tu、Xiangjun Song和Kezong Qi。他们分别来自安徽农业大学的动物科技学院、安徽省动物食品质量与生物安全工程实验室以及信息与人工智能学院。该研究于2024年2月12日发表在期刊《Veterinary Sciences》上。
学术背景
本研究的主要科学领域为兽医微生物学，特别是通过宏基因组学（metagenomics）技术分析安徽省大型养猪场中母猪粪便的微生物群落结构及其携带的抗生素抗性基因（antibiotic-resistance genes, ARGs）和毒力基因（virulence genes）。研究背景在于，抗生素在畜牧业中的滥用导致了抗性基因在环境中的富集，对人类和动物健康构成威胁。此外，毒力基因的存在可能使非致病菌转化为致病菌，进一步加剧公共卫生风险。本研究旨在通过宏基因组测序技术，揭示母猪在不同生理阶段粪便中微生物群落的多样性及其抗性基因和毒力基因的分布特征，从而为制定科学的养猪政策和管理措施提供依据。
研究流程
1. 样本采集
研究从安徽省某大型养猪场采集了不同生理阶段（包括后备期、空怀期、妊娠期和配种期）的母猪粪便样本。每个阶段采集不少于3个样本，每个样本不少于10克。样本采集后立即置于干冰中低温保存，并运输至实验室，存放于-80°C冰箱中，以避免样本间的交叉污染。
DNA提取与宏基因组测序
从样本中提取总基因组DNA，并通过1%琼脂糖凝胶电泳评估DNA的浓度和质量。合格基因组DNA使用Covaris® M220超声波破碎仪随机打断至约400碱基对（bp），并利用NextFlex™ Rapid DNA-Seq Kit构建PE文库。文库通过质检后，使用Illumina测序平台进行测序，每个样本至少产生40,000,000条原始读序。
数据组装与注释
测序数据首先使用Fastp（v0.20.0）进行质量控制，然后使用BWA（v0.7.9a）去除宿主污染。优化后的序列通过MEGAHIT（v1.1.2）进行拼接和组装，并使用Prodigal（v2.6.3）进行开放阅读框（ORF）预测。物种注释通过Kraken2（默认参数）完成。
非冗余基因集构建
使用CD-HIT软件（v4.6.1）对所有样本中预测的基因序列进行聚类，构建非冗余基因集，以探索不同样本间的共性和差异。
个性化分析
通过与NR数据库（v20200604）比对，获得每个样本在域、界、门、纲、目、科、属、种等分类水平上的物种和丰度信息。进一步使用CARD（v3.0.9）和VFDB（v2020.07.03）数据库对ARGs和毒力基因进行分析。
主要结果
1. 宏基因组测序结果与多样性分析
研究对12个样本进行了宏基因组测序，每个样本的N50值在715至1051 bp之间。预测的ORF数量平均为477,706个。Alpha多样性分析显示，妊娠期（SC）样本的微生物多样性最高，而配种期（XZ）样本的多样性最低。Beta多样性分析表明，妊娠期样本的群落组成与其他组存在显著差异。
微生物群落结构
在域分类水平上，粪便微生物以细菌为主，平均相对丰度为97.99%。病毒和古菌的平均丰度分别为0.65%和0.32%。在细菌门水平上，变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）占主导地位，其中妊娠期样本中变形菌门的丰度高达66.6%。
抗生素抗性基因（ARGs）
研究共鉴定出872种ARGs亚型，其中多药类（multidrug-like）、MLS类（MLS-like）和四环素类（tetracycline-like）ARGs在所有样本中含量最高。抗生素失活（antibiotic inactivation）是主要的抗性机制。
毒力基因
通过与VFDB数据库比对，共注释到446个毒力基因，其中粘附相关基因（adhesion-related genes）最为丰富。
结论
本研究通过宏基因组测序技术，揭示了安徽省大型养猪场中母猪在不同生理阶段粪便中微生物群落的多样性及其抗性基因和毒力基因的分布特征。研究结果表明，妊娠期母猪粪便的微生物多样性最高，且抗性基因与总微生物群落之间存在显著正相关。此外，毒力基因的分布在不同细菌物种间无明显差异。这些发现为制定科学的养猪政策和管理措施提供了重要依据。
研究亮点
1. 首次通过宏基因组学技术系统分析了安徽省大型养猪场中母猪粪便的微生物群落结构及其抗性基因和毒力基因的分布特征。
2. 揭示了妊娠期母猪粪便微生物多样性与抗性基因之间的显著相关性。
3. 提供了关于ARGs和毒力基因在养猪场环境中的分布和丰度的详细数据，为控制抗生素滥用和预防疾病传播提供了科学依据。
其他价值
本研究不仅为兽医微生物学领域提供了新的研究方法和数据支持，还为公共卫生和环境保护提供了重要的参考信息。通过揭示ARGs和毒力基因在养猪场环境中的分布，研究为减少抗生素滥用、控制抗性基因传播以及保障食品安全和人类健康提供了科学依据。