类型a

主要作者与研究机构及发表信息
该研究的主要作者包括郭浩春（Haochun Guo）、陈佳佳（Jiajia Chen）和余涵旭（Hanxu Yu），他们来自东南大学医学院附属中大医院肿瘤科、南京医科大学康达学院涟水人民医院放疗科、江苏护理职业技术学院以及扬州大学医学院江苏省中西医结合防治老年疾病重点实验室。这篇论文于2023年9月7日在线发表在《International Immunopharmacology》期刊上。

学术背景
放射性肺损伤（Radiation-Induced Lung Injury, RILI）是胸部肿瘤放疗常见的副作用，包括早期的放射性肺炎（Radiation Pneumonitis, RP）和晚期的放射性肺纤维化（Radiation-Induced Pulmonary Fibrosis, RIPF）。RILI的发生机制尚未完全明确，目前尚无批准或有效的治疗方法，因此探索有效的治疗策略具有重要意义。电离辐射会引起组织和细胞中的DNA损伤和氧化应激，进而诱导细胞衰老并促进RILI的发展。近年来，山莨菪碱（Anisodamine，又称654-2）在急性肺损伤、急性肾损伤、衣原体肺炎和COVID-19等疾病中显示出潜在的治疗价值。然而，关于654-2对细胞衰老的影响及其在RILI中的预防和治疗作用的研究尚属空白。本研究旨在探讨654-2是否通过激活Nrf2/ARE信号通路抑制细胞衰老，从而缓解X射线诱导的RILI。

研究流程
本研究分为体内实验和体外实验两部分，详细流程如下：

1. 体内实验

   • 实验动物：购买了20只6-8周龄、体重16-18克的C57BL/6雄性小鼠，随机分为对照组、模型组、药物组（对照+654-2）和治疗组（模型+654-2）。
     
   • 模型建立：使用18 Gy X射线对小鼠进行全胸照射，建立RILI模型。药物组和治疗组的小鼠每隔一天腹腔注射5 mg/kg 654-2，直至第6周处死。
     
   • 样本处理：处死后收集小鼠肺组织，用于组织病理学观察、炎症因子检测、细胞衰老分析、蛋白表达分析和抗氧化能力测定。
     

2. 体外实验

   • 细胞培养：使用MLE-12细胞系，将其分为对照组、模型组和模型+654-2组（2 μM和10 μM浓度）。
     
   • 照射条件：使用16 Gy X射线单次照射，剂量率为300 cGy/min。
     
   • 实验内容：检测DNA损伤、细胞凋亡、活性氧（ROS）水平、细胞衰老及相关蛋白表达。
     

3. 实验方法

   • 组织病理学分析：采用HE染色和Masson染色评估肺组织形态和纤维化程度。
     
   • 炎症因子检测：通过ELISA分析支气管肺泡灌洗液（BALF）和血清中的TNFα、IL-6、IL-1β等炎症因子水平。
     
   • 细胞衰老检测：使用SA-β-gal染色法检测衰老细胞，并通过Western blot和qRT-PCR分析p16、p21等衰老标志物的表达。
     
   • DNA损伤检测：通过γH2A.X免疫荧光染色和Western blot分析DNA损伤焦点。
     
   • 抗氧化能力测定：检测肺组织和细胞中的MDA、GSH、SOD和LDH水平。
     
   • Nrf2信号通路分析：通过免疫荧光、Western blot和qRT-PCR检测Nrf2的核转位、磷酸化及下游基因表达。
     

主要结果
1. 654-2缓解RILI病理进展
HE染色显示，模型组小鼠肺组织出现明显的间质水肿、炎性细胞浸润和肺泡壁增厚，而654-2显著减轻了这些病理变化。Masson染色进一步表明，654-2减少了胶原纤维的增生。此外，654-2还显著降低了模型组小鼠的体重下降幅度。

1. 654-2缓解肺部和全身炎症
   Diff-Quik染色显示，模型组BALF中的炎性细胞数量显著增加，而654-2显著减少了炎性细胞浸润。ELISA结果显示，654-2显著降低了BALF和血清中的TNFα、IL-6和IL-1β水平，表明其具有抗炎作用。

2. 654-2减轻DNA损伤和细胞衰老
   SA-β-gal染色和Western blot分析显示，模型组小鼠肺组织中衰老细胞数量显著增加，p16和p21表达上调，而654-2显著减少了衰老细胞数量并下调了相关蛋白表达。γH2A.X免疫荧光染色表明，654-2显著降低了DNA损伤焦点的数量。

3. 654-2减少细胞凋亡并增强抗氧化能力
   TUNEL染色和流式细胞术分析显示，654-2显著减少了辐射诱导的细胞凋亡。同时，654-2显著降低了ROS水平，增加了GSH和SOD活性，表明其具有抗氧化作用。

4. 654-2激活Nrf2/ARE信号通路
   Western blot和qRT-PCR分析表明，654-2显著促进了Nrf2的核转位和磷酸化，并上调了下游抗氧化基因（如HO-1、NQO1、GCLC和GCLM）的表达。此外，654-2通过促进p62依赖的自噬降解KEAP1，释放Nrf2进入细胞核，从而增强抗氧化能力。

结论与意义
本研究表明，654-2通过激活Nrf2/ARE信号通路，增强细胞抗氧化能力，抑制细胞衰老，从而缓解RILI。这一发现为未来开发RILI的治疗策略提供了理论基础，同时也为探索RILI的发病机制提供了参考。

研究亮点
1. 首次揭示了654-2在RILI中的保护作用及其机制。
2. 提出了654-2通过p62依赖的自噬降解KEAP1，激活Nrf2信号通路的新机制。
3. 研究设计严谨，涵盖了体内和体外实验，数据支持充分。

其他有价值的内容
本研究还探讨了654-2在多种生物过程中的作用，包括抗炎、抗氧化、抗凋亡和抗衰老，为其在其他疾病中的应用提供了潜在方向。