本研究由Raphael Bereiter、Laurin Flemmich、Kamila Nykiel、Sarah Heel、Stephan Geley、Malou Hanisch、Clemens Eichler、Kathrin Breuker、Alexandra Lusser和Ronald Micura共同完成。研究团队来自奥地利因斯布鲁克大学的有机化学研究所和分子生物科学中心（CMBI）、因斯布鲁克医科大学生物中心的分子生物学研究所以及病理生理学研究所。该研究于2024年11月15日发表在《Nature Chemical Biology》期刊上。
RNA（核糖核酸）在细胞中扮演着至关重要的角色，包括基因表达调控、信号传递和催化反应等。然而，RNA的研究面临诸多挑战，尤其是在活细胞中对RNA进行精确的化学标记和操纵。目前，RNA研究主要依赖于RNA与其配体之间的非共价结合，但这种方法在稳定性和特异性上存在局限。共价RNA标记技术虽然具有潜力，但其发展相对滞后，尤其是在活细胞中的应用。
本研究的目标是通过结构引导的方法，设计一种能够在活细胞中实现RNA与小分子共价结合的策略。具体来说，研究团队希望通过修饰RNA配体，使其能够与RNA结合位点的鸟嘌呤（guanine）发生共价反应，从而实现对RNA的共价标记。
研究分为多个步骤，主要包括以下几个关键环节：
RNA配体的设计与合成
研究团队选择了已知的RNA适配体系统，包括天然存在的mRNA核糖开关（riboswitch）和体外筛选的荧光激活适配体（FLAPs）。通过结构分析，团队设计了一种带有亲电基团的配体，使其能够与RNA结合位点的鸟嘌呤N7原子发生共价反应。
体外实验验证
研究团队首先在体外验证了这种共价结合策略的有效性。他们选择了PreQ1-I核糖开关作为模型系统，合成了带有溴丙基（bromopropyl）修饰的配体（BrC3DPQ1），并将其与PreQ1 RNA适配体进行反应。通过高效液相色谱（HPLC）和质谱分析，团队确认了共价结合产物的形成，并确定了反应的最佳条件（如pH值和反应时间）。
荧光适配体的共价标记
为了进一步验证该策略的通用性，研究团队还开发了一种共价荧光适配体系统（CoFLAP）。他们选择了Pepper适配体，并合成了带有溴丙基修饰的荧光配体（BrC3HBC）。实验表明，这种共价结合系统在活细胞成像中表现出优异的荧光稳定性，甚至在洗涤后仍能保持强荧光信号。
活细胞实验
研究团队在人类胚胎肾细胞（HEK293T）中表达了Pepper适配体，并验证了共价配体在活细胞中的结合能力。通过荧光成像和超分辨率显微镜技术，团队证明了共价结合系统在活细胞中的应用潜力。
RNA动力学研究
研究团队还利用共价结合系统进行了荧光恢复实验（FRAP），以研究RNA在细胞内的动态行为。结果表明，共价结合的配体能够稳定地标记RNA，从而为RNA动力学研究提供了新的工具。
共价结合产物的生成
研究团队成功合成了多种带有亲电基团的RNA配体，并在体外和活细胞中实现了与RNA的共价结合。通过质谱分析，团队确认了共价结合产物的形成，并确定了反应位点为RNA结合位点的鸟嘌呤N7原子。
荧光适配体的共价标记
共价结合的Pepper适配体在活细胞中表现出优异的荧光性能，能够抵抗洗涤过程中的荧光损失，适用于超分辨率显微镜和FRAP实验。
RNA动力学研究
共价结合系统为研究RNA在细胞内的动态行为提供了新的工具，特别是在FRAP实验中表现出独特的优势。
科学价值
本研究开发了一种新的RNA共价标记策略，为RNA研究提供了更稳定和特异的工具。通过共价结合，研究人员可以更精确地研究RNA的结构、功能和动态行为。
应用价值
该策略在活细胞成像、超分辨率显微镜和RNA动力学研究中具有广泛的应用潜力。此外，共价结合系统还可用于RNA靶向药物的开发，为RNA治疗提供了新的思路。
创新性方法
本研究首次提出了一种基于结构引导的RNA共价标记策略，通过修饰RNA配体实现与RNA的共价结合。
广泛适用性
该策略不仅适用于核糖开关，还可用于荧光适配体等多种RNA系统，展示了其广泛的适用性。
活细胞应用
研究团队成功在活细胞中验证了共价结合系统的有效性，为RNA研究提供了新的工具。
研究团队还探讨了共价结合系统在RNA靶向药物开发中的应用潜力。通过合成带有亲电基团的药物样分子，团队展示了该策略在RNA药物设计中的可行性。
总之，本研究通过开发一种新的RNA共价标记策略，为RNA研究提供了重要的工具和方法，具有广泛的应用前景。