本文是由Yingjie Guo、Yan Xia、Zeyu Liang、Shenyan Yang、Shuyuan Guo、Lichao Sun和Yi-Xin Huo等作者共同完成的研究论文，发表于2024年8月9日的《ACS Synthetic Biology》期刊上。该研究主要探讨了如何通过基因工程手段提高质粒在宿主细胞中的稳定性，从而实现无抗生素的化学发酵生产。研究团队通过荧光高通量筛选方法，成功筛选出具有高质粒稳定性的菌株，并揭示了其背后的遗传机制。

研究背景

质粒（plasmid）作为外源基因表达的载体，广泛应用于重组蛋白和高价值物质的工业生产中。然而，质粒在宿主细胞中的复制和分离过程会给细胞带来负担，导致质粒丢失和生产效率下降。为了维持质粒的稳定性，通常需要使用抗生素作为选择压力，但这不仅增加了成本，还可能导致抗生素耐药性的产生。因此，开发无抗生素的质粒稳定系统具有重要的工业应用潜力。

研究流程

研究团队首先构建了基于荧光的高通量筛选系统，用于从大肠杆菌（Escherichia coli）MG1655和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）168的基因组片段缺失库中筛选出具有高质粒稳定性的菌株。具体步骤如下：

1. 质粒构建与转化：研究团队构建了含有荧光基因sfGFP的质粒pGYJ-2，并将其转化到58个基因组片段缺失的大肠杆菌菌株中。通过荧光强度与细胞密度的比值（sfGFP/OD600）来评估质粒的稳定性。

2. 高通量筛选：在无抗生素培养基中连续传代培养，筛选出在多次传代后仍保持高荧光强度的菌株。最终筛选出5个具有高质粒稳定性的菌株，分别为ECΔ8、ECΔ50、ECΔ52、ECΔ54和ECΔ55。

3. 质粒保留频率测定：为了进一步验证筛选结果，研究团队构建了一个大质粒pGYJ-3，并通过平板计数法测定质粒保留频率。结果显示，ECΔ50菌株在三次传代后质粒保留频率仍保持在90%以上，显著高于野生型菌株MG1655。

4. 质粒拷贝数（PCN）分析：通过定量实时PCR分析，发现ECΔ50菌株的质粒拷贝数显著高于野生型菌株，表明其具有更高的质粒稳定性。

5. 基因编辑与机制研究：为了探究ECΔ50菌株质粒稳定性提高的机制，研究团队进行了分段基因敲除实验，发现某些基因片段的缺失协同作用，提高了质粒的分离稳定性和复制控制。

6. 无抗生素发酵应用：研究团队将ECΔ50菌株应用于无抗生素的L-丙氨酸发酵中，结果显示其产量比野生型菌株提高了2.9倍。此外，ECΔ50菌株在异丁醇发酵中也表现出较高的质粒稳定性和生产效率。

主要结果

1. ECΔ50菌株的质粒稳定性：ECΔ50菌株在无抗生素条件下表现出极高的质粒稳定性，质粒保留频率在三次传代后仍保持在90%以上，质粒拷贝数显著高于野生型菌株。

2. BSΔ44菌株的质粒稳定性：在枯草芽孢杆菌中，BSΔ44菌株通过删除噬菌体Spp1表面受体基因yueB，显著提高了质粒的分离稳定性和宿主适应性。在无抗生素发酵中，BSΔ44菌株的乙偶姻产量比野生型菌株提高了61.99%。

3. 无抗生素发酵应用：ECΔ50和BSΔ44菌株在无抗生素发酵中表现出显著的生产优势，分别提高了L-丙氨酸、乙偶姻和2,3-丁二醇的产量。

结论

该研究通过高通量筛选和基因编辑技术，成功筛选出具有高质粒稳定性的菌株ECΔ50和BSΔ44，并揭示了其背后的遗传机制。这些菌株在无抗生素发酵中表现出显著的生产优势，为工业发酵和代谢工程应用提供了新的底盘细胞。研究还表明，通过协调删除与质粒分离和复制控制相关的基因，可以有效提高质粒的稳定性。

研究亮点

1. 高通量筛选方法：研究团队开发了基于荧光的高通量筛选系统，能够快速筛选出具有高质粒稳定性的菌株。

2. 无抗生素发酵：研究成功实现了无抗生素的化学发酵，显著提高了目标化学品的产量，具有重要的工业应用价值。

3. 基因编辑与机制研究：通过分段基因敲除和转录组分析，揭示了质粒稳定性提高的遗传机制，为未来的代谢工程研究提供了新的思路。

研究意义

该研究不仅为无抗生素发酵提供了新的底盘细胞，还揭示了质粒稳定性的遗传机制，为未来的工业发酵和代谢工程应用提供了重要的理论支持。通过减少对抗生素的依赖，该研究有望推动绿色生物制造的进一步发展。