类型a

研究作者与发表信息
本研究由Garrett Jones、Tae Jin Lee、Joshua Glass、Grace Rountree、Lane Ulrich、Amy Estes、Mary Sezer、Wenbo Zhi、Shruti Sharma和Ashok Sharma共同完成，主要作者来自Augusta University的生物技术与基因组医学中心、眼科系以及人口健康科学系。论文发表于《International Journal of Molecular Sciences》（IJMS）期刊，2022年2月19日在线出版。

学术背景
泪膜是一种覆盖在眼角膜和结膜上皮表面的多层液体，具有润滑、提供营养和保护眼睛免受外界环境侵害的功能。由于其靠近眼部疾病的发生部位且采集方式非侵入性，泪液中的蛋白质被认为是潜在的眼部疾病（如干眼症）生物标志物来源。然而，泪液蛋白组学分析面临诸多挑战，包括样本体积小和蛋白质动态范围广等问题。近年来，质谱技术（Mass Spectrometry, MS）的进步显著提高了蛋白质鉴定的深度、速度和准确性，即使在小样本量的情况下也能实现高精度分析。本研究旨在比较四种不同的质谱工作流程，以优化泪液蛋白组学分析方法，并探索健康人泪液的蛋白质组成及其生物学意义。

研究方法与实验设计
本研究主要包括四个步骤：样本收集、蛋白质消化、质谱分析及数据分析。

1. 样本收集
   研究从11名健康志愿者中收集泪液样本，使用Schirmer试纸条（TearFlo, Hub Pharmaceuticals）。每位受试者的试纸条被纵向切成两半，分别用于两种蛋白质消化方法。样本的处理严格遵循伦理委员会批准的方案。

2. 蛋白质消化
   研究比较了两种蛋白质消化方法：提取后消化（Method A）和原位消化（Method B）。

• 在Method A中，蛋白质首先通过缓冲液提取，随后通过离心过滤去除试纸条，再进行胰蛋白酶消化。
  
• 在Method B中，试纸条直接切碎并进行原位蛋白质消化。两种方法均使用8 M尿素溶液进行还原和烷基化处理，并用胰蛋白酶（Trypsin）进行过夜消化。
  

1. 质谱分析
   采用Orbitrap Fusion Tribrid质谱仪进行LC-MS/MS分析。每个样本分别使用碰撞诱导解离（Collision-Induced Dissociation, CID）和高能碰撞解离（Higher-Energy Collisional Dissociation, HCD）两种碎裂技术进行检测。肽段通过PepMap100 C18柱分离，并以梯度洗脱的方式进行分析。

2. 数据分析
   原始质谱数据通过Proteome Discoverer软件处理，并使用SequestHT算法对SwissProt人类数据库进行搜索。数据分析包括蛋白质鉴定、定量分析和统计检验。此外，还进行了基因本体论（Gene Ontology, GO）富集分析和Ingenuity Pathway Analysis（IPA）网络分析，以揭示蛋白质的功能和相互作用。

主要结果
1. 不同工作流程的蛋白质鉴定数量对比
- Method A结合CID和HCD分别鉴定了489 ± 90和496 ± 85个独特蛋白质。
- Method B结合CID和HCD分别鉴定了666 ± 161和678 ± 180个独特蛋白质。
统计分析表明，Method B显著提高了蛋白质鉴定数量（p-value < 0.05）。类似的趋势也在肽段水平上观察到，Method B在CID和HCD条件下分别鉴定了1720 ± 543和1735 ± 567个独特肽段，显著高于Method A。

1. 泪液蛋白质组学特征
   使用Method B结合HCD的工作流程，共鉴定了3370个独特蛋白质，平均每个样本678个蛋白质。这些蛋白质根据其在样本中的检出率分为四类：高表达（>75%样本中检出）、中表达（50–75%）、低表达（25–50%）和稀有表达（5–25%）。其中，高表达蛋白质包括乳铁蛋白（Lactotransferrin, LTF）、脂钙蛋白-1（Lipocalin-1, LCN1）、白蛋白（Albumin, ALB）和催乳素诱导蛋白（Prolactin-Inducible Protein, PIP）。

2. 主要蛋白质家族
   研究发现，免疫球蛋白家族（61种蛋白质）、角蛋白家族（26种蛋白质）、补体家族（17种蛋白质）和载脂蛋白家族（11种蛋白质）在泪液中高度富集。这些蛋白质在维持眼部表面稳态和屏障功能中起重要作用。

3. 功能分析
   GO分析显示，这些蛋白质主要参与内肽酶活性调控、蛋白水解、应激反应和细胞死亡调控等生物学过程。IPA分析揭示了四个主要的经典信号通路：急性期反应信号、糖皮质激素受体信号、LXR/RXR激活和吞噬体形成。

结论与价值
本研究成功优化了一种基于质谱的泪液蛋白组学分析方法，特别是原位蛋白质消化结合HCD碎裂技术显著提高了蛋白质鉴定的数量和质量。研究结果为理解健康泪液的蛋白质组成及其生物学功能提供了重要参考，并为未来开发干眼症及其他眼部疾病的诊断和预后标志物奠定了基础。

研究亮点
1. 首次系统比较了四种质谱工作流程，确立了原位消化结合HCD的最佳方案。
2. 鉴定了3370个独特蛋白质，显著优于以往研究。
3. 揭示了泪液中高度富集的蛋白质家族及其功能，为眼部疾病研究提供了新视角。
4. 结合GO和IPA分析，深入探讨了泪液蛋白质的功能网络和信号通路。

其他有价值内容
研究强调了泪液作为非侵入性生物标志物来源的潜力，特别是在干眼症、角膜炎和其他眼部疾病中的应用前景。此外，研究数据已提交至ProteomeXchange数据库，为后续研究提供了宝贵的资源。