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研究背景与目的

本研究的作者包括李红梅、陈佳、徐斐、曹慧和Maria Eugenia，他们来自上海理工大学医疗器械与食品学院。研究论文发表于2010年第2期的《生物技术通报》（Biotechnology Bulletin）。研究的主要科学领域是酶联免疫测定（ELISA）技术，特别是针对TMB（3,3’,5,5’-四甲基联苯胺）显色体系的优化及其稳定性的研究。

酶联免疫测定法（ELISA）是一种基于抗原抗体结合的高度特异性及酶的高效催化性的免疫分析方法。由于其在临床医学、动物检疫、食品科学等领域的广泛应用，ELISA的灵敏度和准确性至关重要。然而，ELISA测定中最后一步显色体系的灵敏度和准确性对结果的准确性有着重要影响。目前，关于ELISA底物的文献较为有限，实际应用中常因底物体系选择不当而影响测定结果。因此，本研究旨在优化以辣根过氧化物酶（HRP）为标记酶的TMB显色体系，以提高ELISA测定的准确性和稳定性。

研究方法与流程

研究的主要材料包括酶标板、包被抗原、抗盐酸克伦特罗（CL）单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG、TMB、过氧化脲等。研究分为多个步骤，详细流程如下：

1. 间接ELISA操作：首先用碳酸盐缓冲液将CL完全抗原稀释至蛋白浓度为20 μg/mL，包被酶标板，4℃过夜。随后用含有Tween 20的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤酶标板，加入3%明胶封闭液，37℃作用2小时。接着加入用PBS稀释的抗体及阴性参照血清，37℃作用2小时。最后加入酶标二抗，37℃作用1小时，显色后终止反应，用酶标仪测定各孔在450 nm处的OD值。

2. 显色液配制：将TMB溶于二甲基亚砜（DMSO）中配制A液，将过氧化脲溶于磷酸氢二钠与柠檬酸缓冲液中配制B液，两者按一定比例混合后使用。

3. 最适TMB浓度的选择：用乙醇分别配制不同浓度的TMB溶液，进行间接ELISA测定，确定最佳TMB浓度为3 mg/mL。

4. 最适H2O2浓度的选择：采用不同浓度的H2O2配制底物，确定最佳H2O2浓度为0.74 μg/mL。

5. TMB溶剂种类对显色的影响：比较DMSO和乙醇作为TMB溶剂对显色的影响，发现DMSO作为溶剂时显色更稳定。

6. H2O2溶液与H2O2脲素配制底物显色效果对比：比较H2O2溶液和H2O2脲素配制的底物显色效果，发现H2O2脲素配制的底物稳定性更好。

7. 反应温度对显色的影响：在不同温度下进行ELISA的最后一步显色反应，发现15-40℃范围内OD值无明显波动。

8. ELISA体系中底物灵敏度的测定：采用优化后的显色液进行间接ELISA测定，验证显色体系的灵敏度。

9. A液及B液保存稳定性的研究：将优化后的A液和B液置于4℃冰箱内，定期进行间接ELISA测定，发现可稳定保存60天不影响测定结果。

研究结果与分析

1. 最适TMB浓度的确定：当TMB浓度为3 mg/mL时，相对于标记酶的量已过量，可得到准确的试验结果。TMB浓度过高时，溶液中会产生沉淀，影响测定结果。

2. 最适H2O2浓度的确定：H2O2最适浓度为0.74 μg/mL，浓度过高或过低都会降低ELISA测定的灵敏度。

3. 最适TMB溶剂的确定：DMSO作为TMB溶剂时显色更稳定，且显色液在2小时内可以使用。

4. H2O2溶液与H2O2脲素配制底物显色效果对比：H2O2脲素配制的底物溶液稳定性更好，在4小时内可以使用。

5. 反应温度对显色的影响：在15-40℃的温度范围内进行ELISA测定都可得到较为准确的结果。

6. ELISA体系中底物灵敏度的测定：优化后的显色液可灵敏地显示ELISA测定的结果，实验室自制腹水的效价在10万以上。

7. A液及B液保存稳定性的研究：优化后的显色液在不加任何保护剂的情况下可稳定保存60天，不影响测定结果。

结论与意义

本研究通过对ELISA测定中HRP酶标抗体催化TMB-H2O2体系的反应条件进行研究，得到了较为灵敏的底物显色体系。该显色体系在15-40℃范围内进行ELISA测定都可得到较为准确的结果，且A液和B液在4℃下可稳定保存60天，不影响测定结果。这一研究成果为大多数实验室的ELISA研究提供了可靠的显色体系，并为市售试剂盒或检测仪器显色试剂的研制奠定了试验基础。

研究亮点

1. 重要发现：确定了TMB显色体系的最佳条件，包括TMB浓度、H2O2浓度、溶剂种类、反应温度等，显著提高了ELISA测定的准确性和稳定性。

2. 方法创新：采用DMSO作为TMB溶剂，显著提高了显色液的稳定性和灵敏度。

3. 应用价值：优化后的显色体系可广泛应用于临床医学、动物检疫、食品科学等领域的ELISA测定，具有重要的实际应用价值。

其他有价值的内容

本研究还发现，H2O2脲素配制的底物溶液比H2O2溶液配制的底物溶液稳定性更好，这为未来进一步优化ELISA显色体系提供了新的思路。此外，研究中对A液和B液的保存稳定性进行了详细研究，为市售试剂盒的长期保存提供了实验依据。

本研究通过对ELISA显色体系的优化，显著提高了测定的准确性和稳定性，具有重要的科学价值和实际应用意义。